高春陽 張 羽 張坤峰 于文赫 杜顯元 鄭 瑾 韓占濤

(1.中國地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所；2.中國地質(zhì)大學(xué)(北京) 3.中國石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院有限公司；4.石油石化污染物控制與處理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

0 引 言

石油被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)及生活的各個(gè)領(lǐng)域，包括工業(yè)、農(nóng)業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)等，素有工業(yè)“血液”之稱，目前，全球石油總產(chǎn)量超過30億t[1-3]。然而，在石油的開采以及運(yùn)輸?shù)冗^程中出現(xiàn)的“跑、冒、滴、漏”等現(xiàn)象常導(dǎo)致其進(jìn)入土壤和地下水進(jìn)而造成污染[4-5]。石油是由烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等組成的混合物，具有高黏度、低流動(dòng)性、低揮發(fā)性和低生物降解性等特點(diǎn)，一旦進(jìn)入土壤和地下水將很難通過土壤和地下水的自我凈化能力去除[6]?，F(xiàn)有石油類污染土壤的修復(fù)方法大體包括物理法、化學(xué)法和生物法[7-11]。其中化學(xué)氧化法具有修復(fù)污染物范圍廣、修復(fù)周期短、氧化劑易得等優(yōu)點(diǎn)，是目前處理地下水、沉積物和土壤石油污染的主流方法[12]。

化學(xué)氧化技術(shù)中常用的化學(xué)藥劑包括O3、KMnO4、Na2S2O8和Fenton試劑等，其中Fenton試劑因其氧化后不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物而被廣泛應(yīng)用[13]。在高濃度石油烴污染土壤修復(fù)中通常采用化學(xué)氧化技術(shù)作為預(yù)處理將高濃度的石油烴降低為低濃度的石油烴，然后再采用微生物技術(shù)或自然監(jiān)測(cè)法進(jìn)行后續(xù)修復(fù)[14]。然而，化學(xué)試劑不僅能降解石油烴同時(shí)也是一種殺菌劑，在氧化過程中不可避免地對(duì)土著微生物造成影響，而致使后續(xù)的生物過程失效。因此評(píng)價(jià)化學(xué)氧化后土壤中的微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能基因的變化對(duì)后期的生物降解過程具有重要的意義。

目前在對(duì)Fenton試劑的研究中提出采用固體Na2CO3·1.5H2O2(溶于水后分解：Na2CO3?1.5H2O2→Na2CO3+1.5H2O2)來替代H2O2形成Fenton試劑，通過Na2CO3·1.5H2O2緩慢釋放H2O2來避免與石油烴反應(yīng)時(shí)發(fā)生的自由基淬滅反應(yīng)[15]。因此，本研究采用H2O2和Na2CO3·1.5H2O2所形成的兩種類Fenton試劑對(duì)石油烴污染的土壤進(jìn)行氧化處理，然后通過16s rDNA高通量技術(shù)對(duì)土壤中土著微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能基因進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑材料和儀器

過氧化氫(ω(H2O2)=30%，分析純)、過碳酸鈉(Na2CO3·1.5H2O2，分析純)、四氯化碳(CCl4，分析純)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，分析純)、一水合檸檬酸(C6H8O7·H2O，分析純)，F(xiàn)astDNA kit for soil(MP Biomedicals)，Tris-HCl緩沖液。

實(shí)驗(yàn)土壤采自新疆油田原油污染地區(qū)，挑除石塊、動(dòng)植物殘?bào)w后過2 mm篩，密封后于-70℃冰箱保存。石油污染土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 石油污染土壤的基本理化性質(zhì)

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：KH-600TDB型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、LD5-10B型低速大容量離心機(jī)(江蘇同居科技儀器有限公司)、Oil-480型紅外測(cè)油儀(北京華夏科創(chuàng)儀器股份有限公司)、7900型PCR儀(美國ABI)、QuantiFluorTM-ST 微型熒光計(jì)(美國Promega-GloMax Prome)。

1.2 分析方法

土壤含油率的測(cè)定采用超聲萃取法[16]，即稱取干重為5 g的土壤于EPA VOA瓶中，然后在瓶中加入10 mL CCl4溶液后于100 W的超聲波條件下超聲10 min；隨后在800 r/min的離心機(jī)中進(jìn)行離心5 min；將上清液通過盛有1 cm厚度的無水硫酸鈉(300℃干燥2 h)長(zhǎng)頸玻璃漏斗(漏斗頸部塞有少許玻璃棉)收集至錐形瓶中；然后重復(fù)上述步驟至樣品液無色。最后上清液通過稀釋于紅外測(cè)油儀中進(jìn)行測(cè)定。

1.3 土壤微生物的測(cè)序

采用FastDNA kit for soil試劑盒對(duì)土壤中的DNA進(jìn)行提取，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA，再使用帶有barcode的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.1 Miseq文庫構(gòu)建

Miseq文庫構(gòu)建主要包括以下步驟：

1)通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；

2)使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物；

3)Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；

4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.2 Miseq測(cè)序

Miseq測(cè)序主要包括以下步驟：

1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；

2)以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進(jìn)行PCR合成，在芯片上合成目標(biāo)待測(cè)DNA片段；

3)變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋(bridge)”；

4)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；

5)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；

6)加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；

7)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；

8)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；

9)統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)共分3組，分別為空白組(CK)、H2O2形成的類Fenton試劑組(HP)和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton組(SPC)，每組稱取所采集土壤樣品100 g于250 mL錐形瓶中，實(shí)驗(yàn)前分別配置0.5 M的FeSO4·7 H2O和0.5 M的C6H8O7·H2O溶液，過程中依次加入檸檬酸溶液和硫酸亞鐵溶液，然后加入H2O2溶液和Na2CO3·1.5 H2O2固體，最后補(bǔ)充去離子水使水土比控制為1∶1。藥劑添加后，將錐形瓶置于恒溫?fù)u床中于30℃、150 r/min下反應(yīng)2 d，實(shí)驗(yàn)配方如表2。

表2 實(shí)驗(yàn)配方

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種氧化方式對(duì)原油的降解效果比較

氧化后土壤中的原油含量如圖1所示，由圖1可見，SPC組對(duì)原油的降解效果明顯好于HP組，其中SPC組經(jīng)過氧化后原油含量從42 326.24 mg/kg降解到20 960.33 mg/kg，相應(yīng)的降解率達(dá)到50.48%，而HP組氧化后的原油含量為27 689.33 mg/kg，降解率為34.58%。占升等[15]應(yīng)用H2O2和Na2CO3·1.5H2O2活化Na2S2O8對(duì)PAHs污染的土壤進(jìn)行降解，得出Na2CO3·1.5H2O2活化好于H2O2，這可能是由于Na2CO3·1.5H2O2為有載體的H2O2，在反應(yīng)的過程中緩慢釋放H2O2，進(jìn)而避免了氧化劑產(chǎn)生的自由基間的淬滅反應(yīng)，導(dǎo)致其降解效果更好。

圖1 氧化后各組的原油含量

2.2 兩種氧化方式對(duì)土著微生物多樣性的影響

氧化反應(yīng)后，對(duì)3個(gè)樣品土壤中的Alpha微生物多樣性分析，計(jì)算的Shannon、Simpson、Ace、Chao、Coverage等指數(shù)如表3所示。

表3 土壤樣品微生物群落多樣性指數(shù)

Chao和Ace指數(shù)表征樣品微生物群落豐度，數(shù)值越大豐度越高，從表3得出，兩種氧化劑均使微生物群落豐度降低，未進(jìn)行氧化的CK組，其Chao指數(shù)和Ace指數(shù)分別為287.833 333和283.126 841，而經(jīng)過HP和SPC氧化處理后的Chao和Ace則降低到210～220，且這兩種氧化方式對(duì)微生物群落豐度的影響相差不大。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征微生物的多樣性及均勻性。由表3可知，經(jīng)過氧化處理后Shannon指數(shù)變化不大，即說明氧化后對(duì)微生物的多樣性影響不大。比較兩種氧化劑氧化后的Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)，HP氧化后其Simpson指數(shù)降低，這表明經(jīng)過HP氧化后土壤中的微生物群落均勻性變差，而SPC氧化后的Simpson指數(shù)則變化不大。

通過對(duì)圖2的3個(gè)土壤樣品OUT分布物種Venn圖可以得出CK組、HP組和SPC組共有的OUT有146個(gè)，經(jīng)過氧化處理的HP和SPC組均與未進(jìn)行氧化處理的空白組共有的OUT有166(146+20)，且經(jīng)過HP和SPC氧化后的物種大部分是相同的。

圖2 土壤樣品OUT分布Venn圖

在門水平分析土壤樣品中的微生物群落結(jié)果組成，如圖3所示，化學(xué)氧化后，土壤中的優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生變化，未進(jìn)行氧化的CK組，其優(yōu)勢(shì)菌種為放線菌門(Actinobacteria)占整體的47.16%，其次為變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)分別占總體的31.54%和18.58%。而經(jīng)過HP和SPC氧化后土壤中的優(yōu)勢(shì)物種均變?yōu)榱俗冃尉T(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)則變?yōu)榇渭?jí)優(yōu)勢(shì)種群，但所占的比例各有不同，在HP組中占80.66%，而在SPC組則占據(jù)61.16%。其次CK組中存在的異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)(1.46%)則在氧化后消失。有研究表明[17]放線菌門(Actinobacteria)可以在高溫，低含水量的條件下形成孢子，被認(rèn)為是對(duì)有機(jī)質(zhì)分解均有良好作用的菌門。在本研究中放線菌門在長(zhǎng)期原油污染土壤中形成了優(yōu)勢(shì)菌屬，具有一定的原油降解能力，但經(jīng)過化學(xué)氧化后此菌門變?yōu)榇我患?jí)的優(yōu)勢(shì)物種，因此若后續(xù)進(jìn)行生物修復(fù)，可能化學(xué)氧化具有一定的影響。

圖3 不同氧化處理后樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成(門水平)

2.3 氧化后功能基因變化情況

氧化后功能基因變化采用KEGG基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，具體包括細(xì)胞過程通路、新陳代謝通路、遺傳信息處理通路、環(huán)境信息處理通路、人類病癥相關(guān)通路和生物體系統(tǒng)通路[18]。不同氧化方式氧化前后在KEGG Pathway 功能分類上所含基因數(shù)目和豐度情況如圖4所示。從圖4可看出兩種氧化劑氧化后在基因數(shù)量上均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，未進(jìn)行氧化的CK組總基因數(shù)量為58 093 193個(gè)，而經(jīng)過HP和SPC氧化后總基因數(shù)量則分別下降到36 282 211個(gè)和32 355 524個(gè)，其中對(duì)控制新陳代謝通路上的基因影響最大，由CK的34 975 895個(gè)分別降低到20 775 146和19 424 732個(gè)，SPC對(duì)基因數(shù)量的影響更大。這是由于氧化劑也是殺菌劑，氧化過程中致使一部分的土著微生物死亡所致[14]。然而在各種基因在總體基因的豐度上變化不大，其中HP氧化后在細(xì)胞過程通路和環(huán)境信息處理通路占比略有增加，分別從原占比的3.74和16.3增加到5.68和17.76。

圖4 氧化前后在KEGG Pathway 功能分類上所含基因數(shù)目和豐度情況

3 結(jié) 論

1)H2O2和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton試劑對(duì)原油污染土壤的石油類降解率分別為34.58%和50.48%，Na2CO3·1.5H2O2所形成的類芬頓試劑降解效果更好。

2)H2O2和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton試劑氧化后均對(duì)土壤中的土著微生物豐度產(chǎn)生影響，表征微生物群落豐度的Chao和Ace指數(shù)有原來的287.833 333和283.126 841降低到210～220，且氧化后土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物種群發(fā)生變化，原來的放線菌門(Actinobacteria)變?yōu)榇渭?jí)優(yōu)勢(shì)種群，而變形菌門(Proteobacteria)成為新的優(yōu)勢(shì)種群。

3)氧化后土壤中的總基因數(shù)量降低，兩種氧化方式氧化后總基因數(shù)量由58 093 193個(gè)分別下降到36 282 211個(gè)和32 355 524個(gè)，而各種通路基因在總基因的占比變化不大，其中HP氧化后在細(xì)胞過程通路和環(huán)境信息處理通路占比略有增加，分別從原占比的3.74和16.3增加到5.68和17.76。