楊長(zhǎng)青

一、 用反應(yīng)代謝物從化學(xué)結(jié)構(gòu)上預(yù)測(cè)具有肝毒性的藥物

反應(yīng)代謝物(reactive metabolites，RM)的概念首先來(lái)自于威斯康星大學(xué)醫(yī)學(xué)院米勒課題組的研究。他們首先證明了苯胺類(lèi)偶氮染料的肝毒性和致癌性是由其氧化代謝后形成的RM所引起的。在將這一概念擴(kuò)展到人類(lèi)DILI的研究中，首先發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450 (CYP)介導(dǎo)的抗炎藥對(duì)乙酰氨基酚的RM是反應(yīng)性醌-亞胺中間體，該中間體能夠耗盡機(jī)體內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)，并與肝蛋白共價(jià)結(jié)合。基于這些以及過(guò)去3～4年間的許多其他毒性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)學(xué)研究，現(xiàn)在普遍認(rèn)為，RM才是造成某些特異質(zhì)型DILI的病因。通過(guò)與細(xì)胞表面蛋白共價(jià)結(jié)合形成半抗原，RM可導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙或后繼免疫反應(yīng)。在眾多RM形成實(shí)驗(yàn)中，已推導(dǎo)出這些特定的分子結(jié)構(gòu)，因而將這類(lèi)特定分子結(jié)構(gòu)在已公示的信息中限定為“警示結(jié)構(gòu)”。例如，最近對(duì)68種被召回或與DILI黑框警告(BBW)相關(guān)的藥物進(jìn)行分析表明，其中55種(81%)藥物具有警示結(jié)構(gòu)，而這55種藥物中確有36種(65%)存在RM形成的證據(jù)。因此從結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中也可以看出，RM形成是特異質(zhì)型DILI的一個(gè)令人信服的論據(jù)，而RM缺失與后繼藥物的安全性顯著改善又是一致的。該報(bào)告將突出RM概念和結(jié)構(gòu)警報(bào)的證據(jù)，建議利用結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系作為評(píng)估上市前藥物發(fā)生DILI風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

二、 應(yīng)用微工程化人肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型預(yù)測(cè)藥物DILI風(fēng)險(xiǎn)

芝加哥伊利諾斯大學(xué)的Khetani教授認(rèn)為，動(dòng)物模型中的DILI并不總是與人類(lèi)DILI相關(guān)，部分原因是藥物代謝途徑的物種差異。因此人類(lèi)肝臟的體外模型現(xiàn)在正越來(lái)越多地應(yīng)用于補(bǔ)充、甚至在某些情況下取代動(dòng)物試驗(yàn)；更重要的是，這樣的模型能夠在整個(gè)化合物開(kāi)發(fā)過(guò)程中更快、更經(jīng)濟(jì)地測(cè)試藥物和工業(yè)化學(xué)品的肝毒性。用原代人肝細(xì)胞模型評(píng)價(jià)化合物是篩選DILI風(fēng)險(xiǎn)的理想標(biāo)準(zhǔn)。然而在傳統(tǒng)的二維單細(xì)胞培養(yǎng)模式中，這類(lèi)細(xì)胞還是表現(xiàn)出表型功能的快速下降。他們?cè)谶^(guò)去的10～15年中，運(yùn)用半導(dǎo)體驅(qū)動(dòng)的微加工工具，以及肝細(xì)胞與肝臟或非肝臟來(lái)源的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)，精確調(diào)節(jié)肝細(xì)胞周?chē)亩S和三維微環(huán)境，以增強(qiáng)和穩(wěn)定細(xì)胞表型功能。將肝臟來(lái)源的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(例如庫(kù)普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞)置于工程化肝細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)中，可確定細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用在人類(lèi)DILI進(jìn)展中的作用途徑。利用患者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的人肝細(xì)胞和適應(yīng)性免疫攻擊來(lái)闡明特異性DILI的發(fā)生機(jī)制，也是未來(lái)努力的方向?？傊⒐こ袒烁渭?xì)胞共培養(yǎng)模型具有預(yù)測(cè)上市前藥物發(fā)生DILI風(fēng)險(xiǎn)的巨大潛力，并有助于闡明DILI的潛在機(jī)制。

三、 評(píng)估藥物研發(fā)中DILI風(fēng)險(xiǎn)的新策略

臨床前的動(dòng)物模型對(duì)檢測(cè)大多數(shù)人類(lèi)的DILI普遍不敏感。因此，在藥物研發(fā)過(guò)程中需要對(duì)其DILI風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行廣泛的評(píng)估。來(lái)自舊金山Genentech公司的Proctor博士采用了一組體外模型，并特別考慮了理化特性、警示結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)劑量/暴露，以研究潛在的DILI風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然，在缺乏臨床前體內(nèi)肝毒性信息的情況下，很難利用體外數(shù)據(jù)來(lái)決定化合物的取舍。造成這一挑戰(zhàn)的因素之一是不確定哪些參數(shù)能夠真正預(yù)測(cè)DILI。這在一定程度上也是由于該領(lǐng)域的文獻(xiàn)中有許多相互矛盾的報(bào)道，這些報(bào)道使用了不同的測(cè)試系統(tǒng)、分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法和實(shí)驗(yàn)條件，使得交叉研究比較困難。為了解決這個(gè)問(wèn)題，他們開(kāi)始評(píng)估藥物大量的生理化學(xué)特性，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬酶學(xué)和體外測(cè)定的整體預(yù)測(cè)性，使用一致的驗(yàn)證系統(tǒng)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法單獨(dú)或組合地識(shí)別預(yù)測(cè)各參數(shù)的性能。在使用不同的測(cè)試系統(tǒng)對(duì)173種上市前化合物進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)與臨床DILI相關(guān)的占47%。對(duì)于以IC50值為終點(diǎn)的參數(shù)，他們還通過(guò)校正每個(gè)化合物有效暴露時(shí)的最大血漿濃度來(lái)估計(jì)體外安全邊際(MOS)。

四、 計(jì)算機(jī)模擬和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M，預(yù)測(cè)特異質(zhì)型DILI

在肝臟的適應(yīng)或“耐受”壓力方面，人與人之間存在著差異性，這也是特異質(zhì)型DILI發(fā)生的因素之一。來(lái)自哈姆納藥物安全研究所Howell博士重點(diǎn)討論了這一因素。肝細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的改變影響著胞內(nèi)線粒體的生物形成能力，描述這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的數(shù)學(xué)模型已被納入到DILI評(píng)估系統(tǒng)：DILIsym。DILIsym是一項(xiàng)在歷時(shí)9年努力后，得到了19家最大的制藥公司、FDA和學(xué)術(shù)界共同支持所產(chǎn)生的一個(gè)DILI評(píng)估系統(tǒng)。它采用了“中間”定量系統(tǒng)毒理學(xué)(QST)的方法，并運(yùn)用微分方程來(lái)概括藥物可能導(dǎo)致肝損傷的關(guān)鍵過(guò)程，通過(guò)改變參數(shù)來(lái)創(chuàng)建模擬的患者群體(SimPops)，以反映遺傳和非遺傳性變異。該評(píng)估系統(tǒng)已經(jīng)完成了軟件制作(DILIsym，DILIsym Services Inc.，Simulations Plus公司)，將會(huì)越來(lái)越多地應(yīng)用于制藥公司的開(kāi)發(fā)決策。DILIsym已經(jīng)在多組上市前的藥物中進(jìn)行了測(cè)試，其在80%以上的預(yù)測(cè)病例中都是準(zhǔn)確的。