劉

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000）

運(yùn)輸應(yīng)激是畜牧生產(chǎn)活動中不可避免的一種刺激，在多種應(yīng)激源共同作用下動物生理及行為等方面會發(fā)生變化，同時(shí)生長、繁殖和免疫等功能也受到損害，影響動物生產(chǎn)和福利[1]。運(yùn)輸應(yīng)激會降低肉仔雞的肌肉品質(zhì)而增加血漿皮質(zhì)酮含量[2]，運(yùn)輸后鴿子的皮質(zhì)酮等指標(biāo)升高并表現(xiàn)出心肌和肝臟損傷[3]，隨運(yùn)輸時(shí)間延長大鼠空腸的損傷加劇[4]，運(yùn)輸應(yīng)激也會改變奶牛、肉牛、肉羊和豬血液生化和免疫等指標(biāo)，并對心臟、肝臟或腎臟等器官產(chǎn)生一定損傷[5-7]。以上研究結(jié)果表明，運(yùn)輸應(yīng)激對畜禽和實(shí)驗(yàn)動物的健康、生產(chǎn)和福利均會造成一定影響。

除了影響動物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡外，應(yīng)激也會使細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，細(xì)胞應(yīng)激時(shí)一些具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)（如熱休克蛋白和急性期反應(yīng)蛋白等）新合成或合成增加，成為動物機(jī)體在細(xì)胞、蛋白質(zhì)和基因水平的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)。研究表明，豬心臟和肝臟中HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨運(yùn)輸時(shí)間增加呈上升趨勢[8]；肉牛運(yùn)輸后肝臟、心臟、外周血淋巴細(xì)胞和肌肉中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)增加[9]，運(yùn)輸6 h肉牛血清中HSP70濃度升高[10]。本研究旨在探討運(yùn)輸應(yīng)激對山羊血清和空腸中HSP27、HSP70和HSP90含量的影響，為進(jìn)一步研究山羊運(yùn)輸應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及分組 在江西本地山羊養(yǎng)殖場選擇精神狀態(tài)和健康狀況好、體況相近、體重為（13.89±2.96）kg且經(jīng)檢測布魯菌病陰性的贛西雄性山羊12頭，隨機(jī)分為對照組、運(yùn)輸應(yīng)激2 h組和運(yùn)輸應(yīng)激6 h組。對照組正常環(huán)境下飼養(yǎng)不做處理，運(yùn)輸應(yīng)激處理將山羊裝載到運(yùn)輸車輛上，從06:00至12:00進(jìn)行運(yùn)輸，車內(nèi)溫度在28～32 ，天氣晴朗，車輛行駛速度為35～45 km/h，運(yùn)輸途中禁食禁水，分別在運(yùn)輸2 h（08:00）和6 h（12:00）后對運(yùn)輸山羊經(jīng)頸靜脈采集血液5 mL，靜置后用低速臺式離心機(jī)（TDL-60B，購自上海安亭科學(xué)儀器公司）3 000 r/min離心15 min分離血清并分裝為3管，置-20 冰箱保存?zhèn)溆?。速眠新肌肉注射麻醉，屠宰后選取空腸前段用4 PBS清洗數(shù)次后放入液氮中速凍，然后放入-80 Thermo Scientific超低溫冰箱（購自江西省立康科技有限公司）中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測指標(biāo)和方法 山羊熱休克蛋白HSP27（STH180 003-96T）、HSP70（STH180004-96T）和HSP90（STH 180005-96T）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自北京愛普銳晟科技有限公司，其中純化的山羊熱休克蛋白抗體、抗原以及HRP標(biāo)記的熱休克蛋白抗體均由King Bio-Medical,Inc.提供。參照ELISA試劑盒說明書應(yīng)用雙抗體夾心法測定12只山羊血清和空腸樣本中3種熱休克蛋白水平，每只山羊檢測3份血清和空腸樣本，按要求準(zhǔn)備試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)空白對照孔（不加樣品和酶標(biāo)試劑）、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔將50 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)包被板，將40 μL樣品稀釋液加入待測樣品孔后再加入10 μL待測樣品（稀釋5倍），封板后37 反應(yīng)30 min，棄去液體甩干，洗滌液洗板5次后加入50 μL酶標(biāo)試劑，封板后37 反應(yīng)30 min，棄去液體甩干，洗滌液洗板5次后依次加入50 μL顯色劑A和B，震蕩混勻后37 避光反應(yīng)10 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長下用美國Awareness Chromate 4300酶標(biāo)讀數(shù)儀在15 min內(nèi)測定吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用LSD方法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表明差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊血清HSP27、HSP70和HSP90含量的影響 由表1可見， HSP27含量在3組間無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激2 h組和6 h組HSP70含量極顯著升高（P＜0.01），HSP90含量分別較對照組極顯著升高（P＜0.01）和顯著升高（P＜0.05）。運(yùn)輸應(yīng)激2 h組和6 h組間HSP70、HSP90含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊空腸HSP27、HSP70和HSP90含量的影響 由表2可見，運(yùn)輸應(yīng)激6 h組HSP27含量較運(yùn)輸2 h組極顯著降低（P＜0.01），但運(yùn)輸應(yīng)激組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激2 h組HSP70和HSP90含量顯著升高（P＜0.05），運(yùn)輸應(yīng)激6 h組HSP70和HSP90含量無顯著變化（P＞0.05）。運(yùn)輸應(yīng)激6 h組HSP70和HSP90含量較2 h組極顯著降低（P＜0.01）。

表1 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊血清HSP27、HSP70和HSP90含量的影響 pg/mL

表2 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊空腸HSP27、HSP70和HSP90水平的影響 pg/mL

3 討 論

運(yùn)輸導(dǎo)致牛羊應(yīng)激，一些生理和生化參數(shù)發(fā)生改變，對生產(chǎn)、健康和肉品質(zhì)均造成不利影響。研究運(yùn)輸對動物生理的影響，調(diào)查相關(guān)因子在血液循環(huán)中的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激和疾病易感性有效的生物標(biāo)記，有助于早期鑒別應(yīng)激敏感動物。HSPs在各種環(huán)境壓力下表達(dá)增加。對于山羊，熱帶地區(qū)夏季山羊血清HSP70表達(dá)明顯高于冬季，HSP70高表達(dá)在保護(hù)細(xì)胞免受慢性熱應(yīng)激中發(fā)揮作用[11]；運(yùn)輸后山羊心臟和腎臟HSP70表達(dá)有所升高，HSP70高表達(dá)對肌肉糖原濃度的維持有保護(hù)作用，從而影響反芻動物的肉品質(zhì)[12]。對于肉雞，運(yùn)輸0.5、1、2、4 h后肉雞血清肌酸激酶和乳酸脫氫酶逐漸升高，HSP70濃度運(yùn)輸0.5 h時(shí)變化不明顯，運(yùn)輸1 h以上則明顯升高[2]；在熱應(yīng)激和運(yùn)輸應(yīng)激條件下HSP70濃度在肉雞心臟、肝臟、腎臟和腦組織中升高，肉雞飼養(yǎng)密度增加時(shí)HSP70表達(dá)水平也上升[13]。Zhang等[14]將20頭豬隨機(jī)分為0 （對照組）、1 、2 和4 h運(yùn)輸組，與對照組相比，3個(gè)運(yùn)輸應(yīng)激組豬血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶同工酶明顯升高，實(shí)質(zhì)器官組織細(xì)胞急性損傷，以心肝急性變性為特征，運(yùn)輸2 h時(shí)HSP27表達(dá)水平在心臟中明顯增加，運(yùn)輸4 h時(shí)HSP27在肝臟中增加。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，動物暴露于不利條件導(dǎo)致HSPs家族蛋白表達(dá)增加[15]。HSP70是在哺乳動物中最重要、研究最廣泛的熱休克蛋白，具備一些重要的分子伴侶功能，在新合成蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。在各種環(huán)境和氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞釋放HSP70，激活各種調(diào)節(jié)蛋白而抑制凋亡，對細(xì)胞生存起關(guān)鍵作用，應(yīng)激條件下研究HSP70在血清的表達(dá)有重要意義。已有研究表明，HSP70在應(yīng)激條件下對細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用，如牛胚胎和不同組織在熱應(yīng)激和其他應(yīng)激的刺激下HSP70轉(zhuǎn)錄增加，血液中HSP70濃度升高是慢性應(yīng)激的可靠指標(biāo)，可以被認(rèn)為發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[16-18]。HSP90也是一種分子伴侶可以保護(hù)新合成蛋白正確構(gòu)型，防止蛋白亞單位不合適的折疊和聚集[19]。本研究結(jié)果也表明，山羊運(yùn)輸2 h和6 h后血清中HSP70和HSP90含量都明顯升高，提示山羊?qū)\(yùn)輸應(yīng)激在細(xì)胞水平的適應(yīng)性調(diào)節(jié)與血清中HSP70和HSP90含量升高有密切聯(lián)系。

腸道具有營養(yǎng)吸收和屏障2個(gè)主要功能。與正常豬相比，運(yùn)輸應(yīng)激的豬小腸pH明顯降低，運(yùn)輸后增加的循環(huán)血壓導(dǎo)致腸道局部貧血，不充分的微環(huán)境導(dǎo)致腸道酸中毒，增加腸道通透性及細(xì)菌易位，致使運(yùn)輸后疾病發(fā)生率上升[20]。多種生理和環(huán)境應(yīng)激均可誘導(dǎo)HSPs表達(dá)上調(diào)，HSPs在防止蛋白變性中發(fā)揮重要作用，持續(xù)的細(xì)胞應(yīng)激將損傷腸道黏膜，降低黏膜屏障的保護(hù)作用，從而導(dǎo)致應(yīng)激性潰瘍形成[21]。應(yīng)激促使HSP70合成，反過來抑制腸黏膜細(xì)胞的凋亡，保護(hù)腸黏膜細(xì)胞，HSP70在細(xì)胞應(yīng)激和損傷時(shí)發(fā)揮重要作用，維持腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[22]。有報(bào)道稱，宮內(nèi)生長受限（IUGR）仔豬小腸過表達(dá)HSP70抵抗應(yīng)激保護(hù)上皮細(xì)胞，維持胃腸道的形態(tài)和功能，增加IUGR豬的存活率，并認(rèn)為豬腸黏膜HSP70表達(dá)增加可作為一個(gè)分子標(biāo)記用來判斷IUGR引起的腸道損傷[23]。HSPs是腸上皮在細(xì)胞水平的一個(gè)重要防御體系，存在抗凋亡和抗氧化、抗炎、抵抗應(yīng)激作用，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生存，維持腸黏膜完整性，保護(hù)上皮細(xì)胞的正常代謝，防止腸道功能受損，維持腸道結(jié)構(gòu)和功能[24]。研究表明谷氨酰胺保護(hù)腸黏膜免受損傷促進(jìn)黏膜修復(fù)，這一保護(hù)作用部分由HSP70介導(dǎo)[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，山羊運(yùn)輸2 h空腸中HSP70和HSP90含量較對照組顯著升高，運(yùn)輸6 h與2 h相比3種蛋白含量都極顯著降低，說明運(yùn)輸應(yīng)激初期上調(diào)的HSPs對空腸細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)性作用，但隨著運(yùn)輸時(shí)間延長，在應(yīng)激原不斷刺激下，機(jī)體消耗HSPs的量不斷增加。

4 結(jié) 論

本研究條件下，運(yùn)輸應(yīng)激后山羊血清（運(yùn)輸2 h和6 h）和空腸（運(yùn)輸2 h）HSP70和HSP90含量明顯升高，熱休克蛋白濃度在血清和空腸的變化可能是山羊在運(yùn)輸應(yīng)激條件下的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制。