張云娟，劉洪明

（1.福建省浦城縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，福建浦城 353400；2.煙臺市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊，山東煙臺 264000）

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是指一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的無芽胞、革蘭染色陽性細菌的總稱，是應(yīng)用最早的一種益生菌，已被廣泛添加于各種動物的飼料中。目前，市場上大部分乳酸桿菌菌株是從人和哺乳動物腸道中或土壤中分離到的[1]。由于乳酸菌的益生作用具有宿主特異性，即分離自同一動物腸道的菌類，一般只在本類動物腸道定殖發(fā)揮作用效果更好。為了尋找一種能夠應(yīng)用于豬的益生菌，本研究從豬小腸中分離豬源乳酸菌，并對分離的1株乳桿菌進行了詳細的鑒定，為下一步乳酸菌益生效果的評價提供菌種來源。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

采取昆明某屠宰場豬消化道全套樣品，無菌采取樣品于無菌容器內(nèi)，立即送檢。

1.2 菌株的分離與初步鑒定篩選

將小腸樣品去除糞便，無菌剪開用生理鹽水沖洗，再用生理鹽水將樣品依次進行10，102，103，104，105，106稀釋，取 1mL 稀釋液傾注培養(yǎng)于加碳酸鈣MRS培養(yǎng)基內(nèi)，各稀釋度傾注2個瓶皿，分別在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48h。挑取單個有典型溶鈣圈的菌落，MRS平板劃線傳代，純培養(yǎng)[2]。

1.3 乳酸菌生理生化鑒定

根據(jù)革蘭氏染色鏡檢，參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[2]及《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版和第九版[3，4]，對該株乳酸菌進行以下生化鑒定實驗。

1.4 乳酸菌16SrDNA基因測序及同源性分析

首先通過MRS液體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照BIOTEKE公司細菌DNA提取試劑盒(DP2001)說明，提取乳酸菌的總DNA。利用提取的細菌全基因組DNA作為模板，進行16sDNA PCR擴增。PCR產(chǎn)物，封口膜封口后，送大連寶生物（TaKaRa）公司進行測序。利用Blast，Clustal，DNAman，MEGA 等生物軟件將測序結(jié)果與GenBank下載的菌株16sDNA序列進化樹構(gòu)建并進行同源性分析。同源性達到97.5%認為是一個種或亞種。

2 實驗結(jié)果

2.1 分離菌株的菌落特性結(jié)果

該株純菌種接種到加CaCO3 MRS平板，該菌株菌落特性有溶鈣圈，菌落形態(tài)呈大小不一，白色圓形，邊緣光滑，濕潤有光澤的菌落特征。見圖1。

圖1 LP1乳桿菌菌落特征圖

2.2 分離菌株的染色形態(tài)特性結(jié)果

將該株乳桿菌進行革蘭氏染色鏡檢，1000倍光鏡下該株乳桿菌為無鞭毛，無莢膜，無芽孢的藍紫色革蘭氏陽性桿菌。見圖2。

圖2 LP1乳桿菌染色特征圖

2.3 分離的該菌株的生理生化特性結(jié)果

將該株乳桿菌進行屬的生化試驗，運動性（-）、過氧化氫酶（-）、吲哚（-）、明膠液化（-）、硫化氫（-）、硝酸鹽還原（-）、pH4.5 MRS 生長（+），種的生化特性全為陰性。參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》和《伯杰氏鑒定手冊》，初步判斷LP1為乳桿菌屬，基本推斷LP1為格氏乳桿菌。

2.4 同源性比對結(jié)果

16s-rRNA擴增的DNA送大連寶生物(TaKaRa)公司進行測序，測序的豬源乳桿菌用Blast、Clustal、MEGA 和 DNAstar 等生物軟 件分析，構(gòu)建遺傳進化樹（見圖3），由遺傳進化樹可知，LP1與 L.gasseri（格氏乳桿菌）在同一分支上，說明LP1與L.gasseri的親緣性最近。根據(jù)進化樹的親緣性關(guān)系選擇處在同一大枝上的11條序列進行同源性比對（見圖4），由同源性比對圖可知，LP1與格氏乳桿菌的同源性為98.7%。表型鑒定結(jié)果與分子生物學鑒定結(jié)果一致，即LP1為格氏乳桿菌。

圖3 LP1乳桿菌的進化樹

圖4 LP1乳桿菌的同源性圖

3 討論

益生菌的菌株具有較強的針對性和特異性，在其被制作成活菌制劑后也有一定的專一性，因此本研究直接從健康的豬腸道中進行乳酸桿菌的分離。

(1)益生素具有無污染、無藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。乳酸桿菌制劑作為一種益生素，可通過生物拮抗、改善動物腸道的生態(tài)環(huán)境及提高動物免疫力等機制發(fā)揮其益生素的作用，已被廣泛地應(yīng)用于動物生產(chǎn)中[5]。

(2)乳酸桿菌微生態(tài)制劑作為一種優(yōu)質(zhì)的環(huán)保生態(tài)產(chǎn)品，應(yīng)用前景廣闊[6]。

不同種動物宿主來源的益生菌對動物腸道上皮的粘附性是不同的，影響微生態(tài)制劑的使用效果。益生菌的粘附性好壞也是決定益生素質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[7]。家畜微生態(tài)制劑使用的菌種最好為經(jīng)鑒定的具有優(yōu)良粘附性的源自家畜的益生菌。此次試驗分離到乳酸菌可進一步為乳酸菌益生效果研究提供菌種來源，從而為微生態(tài)制劑的制備篩選優(yōu)良菌種。