王浩，賈婧怡，張杉，張旭，陳江龍，趙麗

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

0 引 言

在食品的生產(chǎn)、包裝過(guò)程中，為抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，需要頻繁對(duì)食品的原料、生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行清洗消毒，其中氯酸鹽和高氯酸鹽作為消毒副產(chǎn)物極有可能會(huì)在嬰幼兒配方乳粉中存在殘留，引發(fā)食品安全隱患。一旦嬰幼兒體內(nèi)的高氯酸鹽過(guò)量，會(huì)出現(xiàn)智商偏低、學(xué)習(xí)障礙、發(fā)育遲緩、多動(dòng)癥、注意力分散甚至弱智等癥狀。氯酸鹽為中等毒性化合物。由于國(guó)家目前還未制定相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，所以對(duì)嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留進(jìn)行監(jiān)控有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前,測(cè)定氯酸鹽和高氯酸鹽的方法主要有離子色譜法[1-2]、離子色譜-質(zhì)譜法[3－7]和高效液相色譜-質(zhì)譜法等[8－11]。但應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽相關(guān)報(bào)道比較少見(jiàn)。本文采用水超聲溶解，乙腈除蛋白，正己烷除脂，內(nèi)標(biāo)法定量，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè),前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，適合于嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的同時(shí)快速檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：配電噴霧源（ESI）和Agilent1200型液相色譜儀；GL-88型渦旋混合器；KQ-5200型超聲波清洗儀。

氯酸鹽和高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品；氯酸鹽-18O3（200μg/mL）和高氯酸鹽-18O4（100μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液；乙腈、正己烷和乙酸銨（均為HPLC級(jí)）；樣品：作者單位檢驗(yàn)樣品；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取128 mg的氯酸鈉標(biāo)于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存；準(zhǔn)確稱(chēng)取123 mg的高氯酸鈉標(biāo)于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存。

中間質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：用超純水將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成氯酸鹽和高氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為2μg/mL和0.2μg/mL的中間質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。

中間質(zhì)量濃度內(nèi)標(biāo)溶液：用超純水將氯酸鹽-18O3（200μg/mL）和高氯酸鹽-18O4（100μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液制成氯酸鹽和高氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為5μg/mL和1μg/mL的中間質(zhì)量濃度內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取陰性樣品,先加入20μL的中間質(zhì)量濃度內(nèi)標(biāo)溶液，再加入適量的中間質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氯酸鹽最終添加質(zhì)量濃度分別為分別為20，50，100，200，500 ng/mL；高氯酸鹽最終添加質(zhì)量濃度分別為分別為2，5，10，20，50 ng/mL。其余處理同1.3。

1.3 樣品前處理

稱(chēng)取1.0 g樣品,精確至0.01 g，置于10 mL具塞比色管中，依次加入氯酸鹽和高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)工作液20μL，加入2 mL溫度60～70℃熱水，渦旋30 s后，再加入3 mL乙腈，具塞振搖使蛋白質(zhì)沉淀，超聲提取10 min，吸取1 mL上清液用4 mL乙腈飽和的正己烷液液分配，除去脂肪，過(guò)0.20μm有機(jī)濾膜后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件為色譜柱：資生堂PC HILIC柱為2.0 mm×150 mm，5μm；流速為0.20 mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為3μL；流動(dòng)相乙腈（A相）和濃度為50 mmoL/L的乙酸銨水溶液(B相)=85+15，體積比。

質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為負(fù)離子模式；檢測(cè)方式為多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣為N2；霧化氣壓力為275.8 kPa；干燥氣溫度為340℃；干燥氣流速為8 L/min；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量如表1所示。內(nèi)標(biāo)法定量。

表1 氯酸鹽和高氯酸鹽的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

氯酸鹽和高氯酸鹽都易溶于水，同時(shí)，考慮到乳粉基質(zhì)復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，所以本方法在樣品中先分別加入2 mL溫度為60～70℃熱水、氯酸鹽和高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)，渦旋1 min，使樣品中氯酸鹽和高氯酸鹽充分溶解，再加入3 mL乙腈，去除樣品中蛋白質(zhì)，再用乙腈飽和的正己烷除脂。這種前處理的方法簡(jiǎn)便快速，氯酸鹽和高氯酸檢出限低（分別為10 μg/kg和1μg/kg），加標(biāo)回收率高（平均加標(biāo)回收率＞85%），可以完全滿足實(shí)際檢測(cè)要求。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式分別將質(zhì)量濃度為200 ng/mL的氯酸鹽、氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽和高氯酸鹽-18O4等4種化合物用蠕動(dòng)泵注入離子源中，在電噴霧負(fù)離子方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q 1掃描)，得到分子離子，即母離子。由于氯酸鹽分子量較小，碎裂電壓較高時(shí)，[M-H]-分子離子峰易斷裂，造成離子化效率不高，因此，本方法選擇碎裂電壓為30V，同理，氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽和高氯酸鹽-18O4碎裂電壓分別為40，70，50V；再對(duì)化合物的分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息，即子離子；然后優(yōu)化4種目標(biāo)化合物的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)，得到每種化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖；按照二級(jí)質(zhì)譜圖提供的碎片離子信息，選擇4種目標(biāo)化合物的定性和定量離子，得到氯酸鹽、氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽和高氯酸鹽-18O4等4種化合物的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本研究分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,5μm)、資生堂PC HILIC柱色譜柱(150 mm×2.0 mm,5μm)和Atiantis HILIC Silica色譜柱(100 mm×2.1 mm,3μm)進(jìn)行分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)資生堂PC HILIC柱色譜柱(150 mm×2.0 mm,5μm)效果較好,氯酸鹽和高氯酸鹽的峰形及靈敏度均優(yōu)于其余兩款色譜柱。

2.3.2 色譜分離條件選擇

由于PC HILIC色譜柱一般都采用乙腈-乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相。首先比較了乙腈和濃度為10 mmoL/L的乙酸銨水溶液、20 mmoL/L的乙酸銨水溶液、30 mmoL/L乙酸銨水溶液、40 mmoL/L乙酸銨水溶液、50 mmoL/L乙酸銨水溶液的色譜行為，發(fā)現(xiàn)乙酸銨水溶液濃度越高時(shí)，氯酸鹽的色譜峰重現(xiàn)性越好；比較了乙腈和濃度為50 mmoL/L的乙酸銨水溶液比例分別為70∶30，80∶20，85∶15，90∶10和95∶5；發(fā)現(xiàn)乙腈和濃度為50 mmoL/L的乙酸銨水溶液比例為85∶15，3 min內(nèi)氯酸鹽和高氯酸鹽能得到有效分離，其他比例氯酸鹽和高氯酸鹽均不能有效分離（結(jié)果如圖1所示）。

2.3.3 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量大可提高測(cè)定的靈敏度,但是容易污染色譜柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到3μL時(shí),靈敏度能達(dá)到要求，且對(duì)色譜柱影響不大。

2.4 線性范圍與檢出限

乳粉富含油脂蛋白質(zhì)，為了消除測(cè)定液中存在的基質(zhì)效應(yīng)，本研究首先在前處理過(guò)程中采取除油和除蛋白處理，同時(shí)采用空白樣品加標(biāo)內(nèi)標(biāo)法配制的基質(zhì)工作曲線，極大程度消除測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)又明顯提高了定量的準(zhǔn)確性。用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣3μL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y為峰面積；x為質(zhì)量濃度，μg/L），同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，在信噪比均大于3的條件下能檢出，將此添加量定為檢出限，在信噪比均大于10的條件下能檢出，將此添加量定為定量限。結(jié)果如表2所示。)

表2 氯酸鹽和高氯酸鹽的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限 μg/kg

2.5 方法的回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱(chēng)取空白樣品6份，每份1.0 g,共3組，分別定量加入目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，第一組添加水平：氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20μg/kg，高氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0μg/kg；第二組添加水平：氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40μg/kg，高氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0μg/kg；第三組添加水平：氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200μg/kg，高氯酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0μg/kg。

按供試品溶液制備方法制備后進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均加標(biāo)回收率85.1%～94.7%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.38%～9.79%（n=6）。圖1為加標(biāo)樣品中MRM色譜圖。

表3 氯酸鹽和高氯酸鹽的加標(biāo)回收率 %

圖1 氯酸鹽和高氯酸鹽的加標(biāo)MRM色譜

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的50種嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)乳粉進(jìn)行檢測(cè)，其中37個(gè)樣品檢出氯酸鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為22.7～1813μg/kg，檢出率74.0%），47個(gè)樣品檢出高氯酸鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為2.37～400μg/kg，檢出率94.0%）。上述結(jié)果表明，嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)乳粉中確實(shí)存在氯酸鹽和高氯酸鹽殘留，其對(duì)嬰幼兒健康存在的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)引起重視。

3 結(jié) 論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本方法的樣品前處理簡(jiǎn)單易行，分析快速，回收率高，定量限及精密度均能滿足殘留檢測(cè)要求，能為我國(guó)嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽污染物殘留的監(jiān)管與監(jiān)督提供技術(shù)支撐。