劉 東 余加林 李志光 賀 雨 杜 華 黃進潔 徐艷珍

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)是新生兒期嚴重威脅患兒生命的疾病，主要病變包括黏膜和黏膜下層的糜爛、壞死、炎癥和細菌侵入，嚴重者可發(fā)生腸壁全層壞死和穿孔。腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能損壞與細菌的入侵被認為是NEC發(fā)病的中心環(huán)節(jié)之一[1]。腸道黏液層是腸黏膜屏障的化學(xué)/機械屏障的重要組成部分。黏蛋白則是腸道黏液層中主要的大分子物質(zhì)，其所賦予腸道黏液層的黏性及其他理化性質(zhì)是保證細菌與腸黏膜屏障之間穩(wěn)態(tài)不可或缺的一環(huán)。目前尚少見NEC患兒腸組織中黏蛋白表達變化的相關(guān)報道。本研究擬通過觀察NEC患兒腸組織黏膜屏障中與細菌關(guān)系最為密切的2種黏蛋白[1型和2型黏蛋白(MUC1 和MUC2)]的表達，探討NEC患兒腸黏膜屏障黏液層的改變，更加深入理解腸黏膜屏障破壞在NEC發(fā)病中的角色。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 病例對照研究。NEC組為NEC患兒手術(shù)腸組織標本病理切片，對照組為先天性腸閉鎖患兒手術(shù)腸組織標本病理切片，觀察2組MUC1及MUC2免疫組織化學(xué)表達變化。

1.2 知情同意和倫理 本研究設(shè)計獲得廣東省深圳市人民醫(yī)院和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會的批準[2016倫審(研)第(106)號]。NEC組和對照組手術(shù)腸組織病理切片均來自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科，手術(shù)和病理檢查均得到了患兒及其監(jiān)護人知情同意。

1.3 NEC組病理切片選取 2017年1月10日至2018年5月31日重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科NEC患兒病理切片共27份，以隨機數(shù)字表法從中隨機選取10份病理切片，并查閱住院病歷收集一般臨床資料(性別、胎齡、生產(chǎn)方式和出生體重等)。

1.4 對照組病理切片選取 2012年3月21日至2018年4月24日重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科先天性腸閉鎖患兒病理切片共241份，查閱住院病歷收集一般臨床資料，以本文選取的NEC患兒的胎齡和發(fā)病日齡行1∶1匹配。

1.5 腸組織病理染色 NEC組和對照組手術(shù)切除的病變腸組織石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。

1.6 腸組織免疫組織化學(xué)檢測 NEC組和對照組病理切片的MUC1和MUC2免疫組織化學(xué)分析由廣東省廣州永諾生物科技有限公司完成。石蠟包埋腸組織標本4 μm切片，常規(guī)脫蠟及水化處理，PBS洗2次，各5 min。用PBS配置新鮮的3% H2O2，室溫封閉5～10 min，PBS洗3次，各2 min。水浴鍋加熱0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入組織切片加熱10～15 min，用自來水冷卻至室溫，將切片取出。PBS洗5 min。滴加5% BSA封閉液，室溫封閉15 min。甩去多余液體，滴加一抗：兔抗人MUC1及MUC2多克隆抗體(Abcam，英國)，抗體工作濃度為MUC1為1∶50，MUC2為1∶400(用已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照)。4℃過夜后在室溫復(fù)溫45 min。PBS洗3次，各2 min。滴加多聚體抗兔IgG-HRP作為二抗(博士德，武漢)，室溫孵育1 h。PBS洗3次，各2 min。DAB顯色：用DAB顯色試劑盒，觀察至目的信號深、背景顏色淺時，立即用蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染20 s，蒸餾水洗2次，各2 min，脫水，將切片放入100%二甲苯10 min透明。中性樹脂50 μL封片，室溫保存。

結(jié)果判定及分析：MUC1及MUC2陽性為黃色、棕黃色、黃褐色，MUC1定位于細胞膜，MUC2定位于杯狀細胞及黏液層。圖像采集用OPTEC CCD TP510(重慶)顯微鏡，應(yīng)用“ImagePro Plus 6.0”圖像分析軟件進行分析，分析200倍視野下各指標在組織內(nèi)陽性產(chǎn)物的光密度，定量分析MUC1及MUC2在腸管組織的表達。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 表1顯示，NEC組及對照組患兒性別、胎齡、生產(chǎn)方式、出生體重和樣本采集日齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 NEC組及對照組患兒臨床資料

2.2 HE染色 圖1 HE染色顯示，NEC組及對照組腸組織結(jié)構(gòu)有明顯差異，NEC組患兒腸組織結(jié)構(gòu)的完整性破壞甚至消失，表現(xiàn)為大量絨毛脫落、壞死，黏膜下層及肌層水腫，毛細血管擴張充血，腸壁層炎性細胞浸潤，腸組織杯狀細胞及隱窩減少。

圖1NEC組和對照組患兒腸組織HE染色(×40)

注 A：對照組腸壁組織結(jié)構(gòu)完整清晰，絨毛排列規(guī)則整齊，上皮完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則有序。B：NEC組患兒腸壁組織結(jié)構(gòu)破壞甚至消失，表現(xiàn)為大量絨毛脫落、壞死，黏膜下層及肌層水腫，毛細血管擴張充血，腸壁層炎性細胞浸潤，腸組織杯狀細胞及隱窩減少

2.3 MUC1及MUC2免疫組織化學(xué)分析 2組免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖2和3。MUC1位于腸組織細胞的細胞膜表面，NEC組與對照組相比，MUC1蛋白表達(以累計光密度值統(tǒng)計)明顯減少(NEC組中位數(shù)780 455.5vs對照組中位數(shù)19 175 070.4，P=0.004)； MUC2位于腸組織細胞杯狀細胞內(nèi)外(由杯狀細胞分泌)，與對照組相比，NEC組患兒腸組織MUC2蛋白表達(以累計光密度值統(tǒng)計)顯著降低(NEC組中位數(shù)3 039 120vs對照組中位數(shù)45 750 707.5，P=0.001)。

圖2NEC組及對照組患兒腸組織MUC1免疫組織化學(xué)

注 MUC1陽性(黃棕色)示其定位于細胞膜水平。A(×40)、B(×200)：對照組；C(×40)、D(×200)：NEC組

圖3NEC組及對照組患兒腸組織MUC2免疫組織化學(xué)

注 MUC2陽性(黃褐色)示其定位于杯狀細胞細胞內(nèi)外。A(×40)、B(×200)：對照組；C(×40)、D(×200)：NEC組

3 討論

NEC預(yù)防和治療面臨著許多棘手的問題，闡明其發(fā)病機制十分迫切。遺傳易感性、腸道不成熟、微血流灌注失衡、異常腸道菌群定植、腸黏膜免疫應(yīng)激性增高等都是NEC的發(fā)病危險因素[1]。盡管迄今為止仍不能確定何種因素起主導(dǎo)作用，但腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)與功能破壞使細菌與機體的正常關(guān)系失衡導(dǎo)致NEC發(fā)生這一觀點逐漸被認可。

本研究對腸黏液層中的兩種主要大分子物質(zhì)MUC1及MUC2的表達變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)2種黏蛋白分子在NEC患兒腸組織中均顯著減少。

在黏蛋白與NEC關(guān)系的研究中，MUC2較早受到關(guān)注。MUC2是分泌型黏蛋白中的一種，能賦予腸道黏液黏性和彈性。以往研究發(fā)現(xiàn)，NEC大鼠的回腸部位MUC2陽性的杯狀細胞數(shù)量減少，MUC2基因表達水平反饋性明顯升高，MUC2蛋白表達減少，表皮生長因子可加速MUC2合成，改善腸道屏障功能[2]。Winnie+/+小鼠(MUC2合成異常)較野生型小鼠(Winnie-/-)易發(fā)生NEC且更重，而膽鹽可降低MUC2表達，促進NEC發(fā)生[3]。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對NEC患兒腸組織MUC2的表達水平進行檢測，結(jié)果表明較對照組明顯降低，與已有動物實驗研究結(jié)果相符。有研究表明，益生菌、母乳中的低聚糖可使MUC2蛋白表達上調(diào)，而這兩者均可降低NEC發(fā)生率[4, 5]。腸黏液層MUC2水平降低可能導(dǎo)致黏液層通透性升高，使細菌更容易穿透黏液層而導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞，其在NEC的發(fā)生過程中可能扮演著重要角色，具體機制尚待進一步闡明。

腸道黏液層中存在的另一種與MUC2截然不同的膜結(jié)合型黏蛋白——MUC1則功能相對多樣。MUC1廣泛分布于人類呼吸道、消化道、泌尿道和生殖道等黏膜組織細胞的細胞膜表面，其分子結(jié)構(gòu)包括細胞內(nèi)和細胞外兩部分，分別是蛋白主體及O-聚糖側(cè)鏈。在這個結(jié)構(gòu)中，其細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)“小尾巴”(MUC1CT)結(jié)構(gòu)尤為引人注意。在不同物種之間，這一結(jié)構(gòu)都十分保守，提示其具有特定的作用。對MUC1功能的研究涉及多種疾病，如腫瘤、呼吸道疾病、眼部疾病以及炎癥性腸病等。與MUC2相比，MUC1功能呈現(xiàn)多樣化，不僅具有抗感染作用，而且對細胞凋亡及炎癥等有調(diào)節(jié)作用。但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)病與MUC1關(guān)系的研究報道。

MUC1的功能包括：①抗感染： 喂養(yǎng)MUC1-/-小鼠空腸彎曲菌后其胃腸道細菌定植的密度較野生型小鼠明顯增高，全身感染的發(fā)生率亦較野生型小鼠明顯增高。與MUC1-/-小鼠相比，表達MUC1的小鼠細胞結(jié)合幽門螺桿菌明顯減少[6]。細菌可與MUC1結(jié)合，但隨之從細胞表面釋放[7]。MUC1胞外黏蛋白結(jié)構(gòu)域較短的患者，如幽門螺桿菌陽性，則更易發(fā)生胃炎，可能是短的MUC1分子使得細菌容易接觸細胞表面受體的緣故[8]。②抗凋亡： MUC1的MUC1CT結(jié)構(gòu)可激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達[9]。而MUC1過表達則可減輕抗癌藥物誘導(dǎo)的3Y1成纖維細胞凋亡[10]。MUC1表達被氧化應(yīng)激激活后可減少活性氧簇(ROS)的水平以及由氧化應(yīng)激引發(fā)的細胞凋亡[11]。MUC1過表達可減輕細胞色素c的釋放，從而抑制凋亡發(fā)生[12]。③調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)：膜結(jié)合型黏蛋白可通過MUC1CT調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。MUC1胞外部分與細菌結(jié)合后，MUC1CT從細胞膜釋放，可激活NF-κB來調(diào)節(jié)炎癥通路[13, 14]。與野生型小鼠相比，基因敲除小鼠Muc1-/-氣道上皮TNF-α、角化細胞趨化因子(KC)水平及NF-κB激活的水平明顯增高[15]。TNF-α可上調(diào)MUC1表達，而MUC1過表達可抑制IL-8表達水平[16]。MUC1作為腸黏液層分布于細胞膜表面的最后一道黏蛋白屏障，在調(diào)整腸黏膜屏障方面具有潛在的重要作用。本研究首次表明NEC患兒腸組織MUC1表達水平較對照組顯著降低，這種變化對于NEC發(fā)生發(fā)展的意義尚待進一步闡明。

本研究表明，NEC患兒腸組織MCU1及MUC2表達水平均顯著降低，說明它們可能參與了NEC的發(fā)病過程，其在NEC發(fā)生發(fā)展中的地位尚需進一步研究。在NEC臨床診療過程中，采取措施避免腸黏膜屏障中MCU1及MUC2表達水平降低，可能為臨床NEC防治提供新的理論依據(jù)及合理干預(yù)方案，并加深對NEC發(fā)病機制的理解。