基于細胞膜損傷的蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的作用機制

寧亞維，楊 坤，何建卓，張 巖，李 強，王志新，賈英民*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000；3.北京工商大學食品學院，北京 100048）

金黃色葡萄球菌是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。因其廣泛存在于自然環(huán)境及人和動物體表，極易造成食品污染。金黃色葡萄球菌污染食品并大量繁殖后能夠產(chǎn)生致病性腸毒素，從而引起消費者發(fā)生食物中毒[1]。據(jù)美國疾控中心報道，每年世界上因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒約有24萬 人次[2]。因此，攻克食源性致病菌——金黃色葡萄球菌污染已成為食品安全領域的重要任務。

糖酯是一種非離子型表面活性劑，具有無毒、易生物降解等特性，在食品和醫(yī)藥領域均有廣泛的應用[3-7]。據(jù)報道，2015年糖酯在全球市場消費量達到5.57億 美元，預計到2020年將達到7.46億 美元[8]。近年來，糖酯除了作為乳化劑被報道外，多項研究表明其對食源性致病菌與腐敗菌具有抑制作用，如乳糖油酸酯可以抑制多種細菌（包括出血性大腸桿菌、單細胞增生李斯特菌等）[9]。糖酯尤其對于革蘭氏陽性菌具有廣泛抑制作用[3]：如乳糖月桂酸酯對單細胞增生李斯特菌具有抑制作用[10]；麥芽糖月桂酸酯可以有效抑制變異鏈球菌[11]；果糖月桂酸酯對變異鏈球菌、凝結芽孢桿菌等具有抑菌活性[12]；蔗糖酯對金黃色葡萄球菌等具有抑制作用[13]。糖酯兼具乳化和抑菌雙重功能，符合現(xiàn)代人對添加劑多功能性營養(yǎng)化的需求，具有較高的工業(yè)化應用潛力。然而，目前關于糖酯抑菌作用機制的研究較少，且最近報道的蔗糖酯機理主要從胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏與DNA結合兩個方面考察[13-14]。由于糖酯具有親水、親油的雙親特性，推測細胞膜的損傷可能是糖酯抑菌的一個主要作用靶位[15]。細胞膜是細胞結構的重要組成部分之一，具有維持細胞完整性與外界屏障功能、物質(zhì)運輸、受體和信息傳遞等作用，一旦細胞膜受到破壞，菌體細胞的正常代謝、生理功能就會受到影響。因此，在抑菌機理研究中細胞膜通常作為最主要的抑菌作用靶位來研究。鑒于上述因素，本研究以食源性致病菌金黃色葡萄球菌為指示菌，從細胞膜損傷（包括膜滲透性與完整性、跨膜電勢、菌體超微結構等方面）角度考察了蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的作用機制，以期為多功能糖酯抑菌產(chǎn)品的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌ATCC 25923由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏；蔗糖月桂酸酯 卡博森斯化學科技（蘇州）有限公司；DiSC3(5)、PBFI、PI美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

F-7000-FL 220熒光分光光度計、H-7650透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Scientific公司；Accuri C6 plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.3 方法

1.3.1 MIC測定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌種制備為1×106CFU/mL菌懸液。最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定根據(jù)Wiegand等[16]的方法略作修改，具體如下：在96 孔無菌微孔板上的2～11 列分別加入100 μL培養(yǎng)基，第12列加入200 μL培養(yǎng)基作為陰性對照；第1列加入200 μL蔗糖月桂酸酯，然后從第1列的孔中吸取100 μL加入到第2列的孔中并用移液槍吸打混勻；重復上述操作直至第10列，從第10列的孔中吸出100 μL液體棄掉；第11列不加入蔗糖月桂酸酯，直接加入濃度為1×106CFU/mL的菌懸液作為陽性對照；將菌液分別加入到第1～11列的孔中，使菌液終濃度約為5×105CFU/mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察結果。

1.3.2 時間-殺菌曲線的繪制

向培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌液中加入蔗糖月桂酸酯，以未添加蔗糖月桂酸酯為空白對照，使菌懸液終濃度為5×105CFU/mL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后取樣，并采用平板計數(shù)法測定培養(yǎng)不同時間后菌液中的活菌數(shù)。以時間為橫坐標，活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標繪制時間-殺菌曲線。

1.3.3 細胞膜電勢的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌于4 000×g離心10 min，收集菌體，用含有10 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液（5 mmol/L、pH 7.2）清洗兩次，重懸制備OD600nm＝0.05的菌懸液。向菌液中加入DiSC3(5)溶液（終濃度為1 μmol/L），于30 ℃黑暗條件下保溫20 min，然后加入KCl溶液（終濃度為100 mmol/L），最后加入不同質(zhì)量濃度的蔗糖月桂酸酯（1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC），對照組為Hepes緩沖液（5 mmol/L、pH 7.4），在激發(fā)波長λex＝650 nm、發(fā)射波長λem＝672 nm的條件下測定熒光強度變化。

1.3.4 細胞膜通透性分析

收集對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌并采用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）制備OD600nm＝0.2的菌懸液。向菌懸液中加入不同質(zhì)量濃度蔗糖月桂酸酯溶液（終質(zhì)量濃度為0 mg/mL、1/2 MIC、MIC）后立即置于37 ℃下保溫，之后加入PI熒光探針溶液（終質(zhì)量濃度為10 μg/mL），并在4 ℃黑暗條件下染色20 min。染色結束后用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體兩遍，再通過流式細胞儀測定PI沾染率。

向上述用磷酸鹽緩沖液制備的菌懸液中加入不同質(zhì)量濃度蔗糖月桂酸酯溶液（終質(zhì)量濃度為0 mg/mL（對照組）、1/2 MIC、MIC），于37 ℃下處理1 h。將菌懸液離心，用相同的磷酸鹽緩沖液清洗并重懸。將SYTO-9和PI探針染料以體積比1∶1混勻，加到各實驗組和對照組中，使終濃度分別為3 μmol/L和20 μmol/L，避光在室溫條件下孵育15 min后用磷酸鹽緩沖液清洗、重懸，用熒光顯微鏡觀察。

1.3.5 細胞膜完整性分析

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）制備為108CFU/mL的菌懸液。將蔗糖月桂酸酯與菌液等體積混合，使蔗糖月桂酸酯終質(zhì)量濃度分別為0 mg/mL（對照組，CK）、1/2 MIC、MIC、2 MIC，并置于37 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在0、15、30、60、90、120 mim后取出2 mL菌懸液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾，濾液于紫外分光光度計下測定260 nm波長處的吸光度。

1.3.6 鉀離子泄漏實驗

采用鉀離子敏感性探針PBFI考察鉀離子的泄漏。首先制備對數(shù)生長期的細胞，清洗并重懸于Hepes緩沖液（含5 mmol/L葡萄糖溶液）中，菌懸液調(diào)整為OD600nm＝0.3。將PBFI探針加入到菌懸液（終濃度為2 μmol/L）中。向菌懸液中加入不同質(zhì)量濃度的蔗糖月桂酸酯（0 mg/mL（對照組，CK）、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC）作用10 min。采用熒光分光光度計在激發(fā)波長346 nm、吸收波長505 nm處測定熒光強度。

1.3.7 菌體超微結構觀察

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌采用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）制備為108CFU/mL的菌懸液，加入蔗糖月桂酸酯（0 mg/mL（對照組，CK）、MIC、2 MIC）作用1 h后，采用相同的磷酸鹽緩沖液清洗3 遍，體積分數(shù)4%戊二醛固定2 h，然后按TEM生物樣品制備法[17]制樣，將清洗好的菌體用體積分數(shù)1%鋨酸和3%戊二醛進行雙重固定，經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗后依次用體積分數(shù)30%、50%、70%、85%、90%和95%乙醇溶液脫水，無水乙醇洗脫兩次、環(huán)氧丙烷洗脫兩次。用環(huán)氧樹脂和環(huán)氧丙烷包埋并在50 ℃聚合48 h，冷卻后于室溫進行超薄切片，染色后使用TEM觀察菌體的微觀結構。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復3 次取其平均值。采用Origin 2016軟件通過單因素方差分析法對實驗結果進行統(tǒng)計分析并作圖，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

圖 1 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的時間-殺菌曲線Fig. 1 Time-killing curve of S. aureus by sucrose laurate

蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的MIC為0.312 5 mg/mL，顯著低于Zhao Lei等[13]報道的蔗糖癸酸酯對金黃色葡萄球菌的MIC（1.24 mg/mL）。圖1顯示，與對照組相比，蔗糖月桂酸酯作用于金黃色葡萄球菌8 h內(nèi)活菌數(shù)迅速降低后趨于穩(wěn)定，作用24 h后活菌數(shù)下降了2.09（lg（CFU/mL）），比對照組的活菌數(shù)降低了5.14（lg（CFU/mL））。結果表明蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，與Staroń等[3]對乳糖脂肪酸酯的抑菌特性的總結一致，即糖酯對革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌作用。

2.2 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌膜電勢的影響

DiSC3(5)是一種細胞膜電勢敏感性熒光探針，當細胞處于正常的膜極化狀態(tài)時能在細胞內(nèi)富集并發(fā)生熒光自猝滅，然而當抑菌物質(zhì)導致細胞膜去極化時，DiSC3(5)會從細胞膜內(nèi)釋放出來，導致熒光信號增加。因此，本研究采用DiSC3(5)探針考察蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜電勢的影響。由圖2可以看出，經(jīng)蔗糖月桂酸酯作用的金黃色葡萄球菌與對照組相比，DiSC3(5)探針的熒光強度呈現(xiàn)劑量依賴性增大，且熒光強度增加較快，僅在4 min內(nèi)即達到峰值，表明蔗糖月桂酸酯會導致金黃色葡萄球菌細胞膜電勢去極化，且對膜電勢的影響較大。上述結果與其他抑菌物質(zhì)如乳酸菌素LLC518對單細胞增生李斯特菌作用機理，以及細菌素bifidocin A對大腸桿菌的作用機制類似，即均可導致細胞膜電勢消散[21-22]。

圖 2 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜電勢的影響Fig. 2 Effect of sucrose laurate on membrane potential of S. aureus

2.3 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性的影響

采用SYTO-9和PI雙染法可直觀觀察到抑菌物質(zhì)對菌體細胞膜的損傷，對于細胞膜完整的菌體，僅有SYTO-9能夠進入細胞內(nèi)將DNA染色呈現(xiàn)綠色熒光；若細胞膜完整性受到破壞，PI進入細胞將核酸染色發(fā)出紅色熒光，此時SYTO-9和PI的熒光信號疊加呈黃色乃至橙紅色[18]。圖3顯示，未經(jīng)蔗糖月桂酸酯處理的金黃色葡萄球菌細胞為綠色熒光；經(jīng)1/2 MIC蔗糖月桂酸酯處理的菌體大多數(shù)呈現(xiàn)黃色熒光；經(jīng)MIC蔗糖月桂酸酯處理的菌體發(fā)出橙色熒光，表明隨著蔗糖月桂酸酯質(zhì)量濃度的增加，細胞膜的損傷程度增大。

圖 3 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性影響的熒光顯微鏡圖Fig. 3 Effect of sucrose laurate on membrane permeability of S. aureus evaluated by fl uorescence microscopy

圖 4 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性影響的流式細胞圖Fig. 4 Effect of sucrose laurate on membrane permeability of S. aureus evaluated by fl ow cytometry

圖4顯示，未經(jīng)蔗糖月桂酸酯作用的菌體基本未被PI沾染，1/2 MIC和MIC蔗糖月桂酸酯作用于金黃色葡萄球菌30 min后，PI探針對菌體細胞的沾染率分別為84.7%和94.1%。結果表明蔗糖月桂酸酯導致金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性受到損傷，且損傷程度與蔗糖月桂酸酯的質(zhì)量濃度呈正相關。Weeks等[19]研究乳酸鏈球菌素對單細胞增生李斯特抑菌機理時，發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素作用10 min后細胞PI沾染率達到59.9%；Li Lirong等[20]采用PI作為熒光探針研究抗菌肽P7作用機理時發(fā)現(xiàn)，P7作用于沙門氏菌1 h后PI沾染率達到83.47%。上述研究表明蔗糖月桂酸酯與乳酸鏈球菌素和抗菌肽P7等物質(zhì)抑菌機制類似，均可以破壞細胞膜的滲透性。

2.4 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜完整性的影響

圖 5 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏的影響Fig. 5 Leakage of intracellular macromolecular substances from S. aureus treated with sucrose laurate

細胞膜作為細菌的外部屏障，能夠保護自身結構的完整性，保證正常的生理活動。若細胞膜系統(tǒng)遭到損傷，便會造成細菌內(nèi)部多種重要生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、糖類等）的泄漏，從而影響正常的合成代謝功能。因此，可以通過測定細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏來反映細菌膜完整性。如圖5所示，與對照組相比，金黃色葡萄球菌經(jīng)不同質(zhì)量濃度的蔗糖月桂酸酯處理后，260 nm波長處的吸光度隨著作用時間的延長逐漸增強，然而各質(zhì)量濃度的最高值僅在0.02左右，表明蔗糖月桂酸酯會造成金黃色葡萄球菌完整性受到輕微破壞，導致胞內(nèi)核酸等生物大分子出現(xiàn)微量泄漏。這與蔗糖葵酸酯對沙門氏菌的完整性影響[14]不同，蔗糖葵酸酯會導致沙門氏菌核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生顯著泄漏（A260nm增加約0.6）。

2.5 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌鉀離子泄漏的影響

圖 6 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌鉀離子泄漏的影響Fig. 6 Effect of sucrose laurate on the leakage of potassium ions in S. aureus

蔗糖月桂酸酯與金黃色葡萄球菌細胞膜的作用可能會使細胞膜上形成跨膜通道，導致細胞內(nèi)小分子物質(zhì)（如鉀離子等）泄漏，因此，本研究通過高靈敏度膜不滲透性探針PBFI考察蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌細胞內(nèi)鉀離子泄漏的影響。由圖6可知，蔗糖月桂酸酯會導致金黃色葡萄球菌細胞鉀離子泄漏，且泄漏量與添加的蔗糖月桂酸酯質(zhì)量濃度呈正相關。因此，推測蔗糖月桂酸酯會破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的滲透性。這與Yang Xu等[23]研究的抗菌肽對金黃色葡萄球菌的作用機制類似，他們也發(fā)現(xiàn)抗菌肽作為“雙親性”物質(zhì)會破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜，導致胞內(nèi)鉀離子發(fā)生顯著性泄漏。

2.6 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌超微結構的影響

圖 7 蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌影響的TEM觀察結果Fig. 7 Transmission electron microscope observation of S. aureus treated with sucrose laurate

通過TEM可直觀地觀察到菌體細胞內(nèi)部及外部超微結構的變化[24]。圖7表明，未經(jīng)蔗糖月桂酸酯處理的金黃色葡萄球菌表面光滑且呈邊緣清晰的球形，細胞質(zhì)分布均勻；經(jīng)MIC蔗糖月桂酸酯作用1 h后，菌體表面變粗糙，邊緣模糊；經(jīng)2 MIC蔗糖月桂酸酯作用1 h后，細胞發(fā)生嚴重形變，菌體細胞膜開始皺縮，胞內(nèi)物質(zhì)密度顯著降低。根據(jù)上述結果推測，蔗糖月桂酸酯作用于金黃色葡萄球菌細胞壁，使其變得疏松粗糙，但并不會使其破裂；其作用于細胞膜，破壞細胞滲透性，導致細胞質(zhì)固縮，胞內(nèi)物質(zhì)輕微泄漏。這與胡靜等[25]利用TEM觀察槐糖酯對金黃色葡萄球菌超微結構影響的結果相似，即槐糖脂作用于金黃色葡萄球菌后，TEM觀察結果顯示其能夠破壞菌體細胞膜和細胞壁，造成細胞質(zhì)固縮、形成空腔。

3 討 論

隨著生活水平的提高，人們對食品添加劑提出了更高的要求。然而，在食品加工過程中為了達到保持食品良好感官性狀、提高食品保藏性能等目的需要使用食品添加劑。雙功能性添加劑由于能夠發(fā)揮雙重作用而受到青睞。

糖酯作為雙功能性添加劑近年來受到人們關注。一方面，糖酯具有親水和親油特性，可作為非離子型乳化劑在食品、醫(yī)藥及化妝品等領域有廣泛應用：Anarjan等[26]發(fā)現(xiàn)蔗糖月桂酸酯作為乳化劑可以制備小粒徑的蝦青素納米乳液；Amalini等[27]發(fā)現(xiàn)糖酯作為表面活性劑加入魚皮明膠中制備的蛋白質(zhì)可食用膜水分滲透性和溶解性均降低；Nakamura等[28]發(fā)現(xiàn)蔗糖脂肪酸酯可以作為潤滑劑，通過直接壓片法制備高硬度和短崩解時間的藥片。另一方面，糖酯對食品中常見的致病菌與腐敗菌具有廣譜抑菌作用：Furukawa等[29]發(fā)現(xiàn)脂肪酸糖酯可以有效抑制食源性致病菌生物膜的形成；Maja等[30]發(fā)現(xiàn)蔗糖月桂酸酯可以抑制蠟樣芽孢桿菌的生長。本研究中所考察的蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌具有較好地抑菌作用（MIC為0.312 5 mg/mL），在食品中可同時發(fā)揮乳化和抑菌雙重作用，在火腿腸、乳飲料等食品生產(chǎn)中具有較大的應用潛力。

目前關于糖酯抑菌活性的相關報道較多，但是對于蔗糖月桂酸酯的抑菌機制目前尚鮮見報道。細胞膜作為菌體自我保護的第一道屏障，在自我防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。本研究利用熒光顯微鏡結合流式細胞術考察了蔗糖月桂酸酯對細胞膜滲透性的影響，通過熒光分光光度法考察細胞膜電勢的變化，采用鉀離子敏感性探針考察小分子物質(zhì)的泄漏，通過260 nm波長處吸光度的變化考察核酸等大分子物質(zhì)的泄漏，最后通過TEM觀察細胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)密度的變化，全方位分析了蔗糖月桂酸酯對細胞膜的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖月桂酸酯可以改變細胞膜電勢，導致鉀離子泄漏，但是不會導致大分子物質(zhì)發(fā)生顯著泄漏，表明蔗糖月桂酸酯主要通過改變細胞膜滲透性但不顯著改變其完整性而發(fā)揮抑菌作用。這與Zhao Lei等[13]對蔗糖葵酸酯對金黃色葡萄球菌細胞膜損傷的研究結果不同，他們認為蔗糖葵酸酯可以顯著破壞細胞膜完整性，導致大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)發(fā)生顯著性泄漏。然而，本研究對于蔗糖月桂酸酯對細胞膜的作用機制主要從細胞層面分析，對于分子層面上的細胞膜作用機制（如是否對細胞膜脂肪酸表達模式及脂蛋白的結構產(chǎn)生影響）有待進一步研究。

綜上，蔗糖月桂酸酯對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用?？梢酝ㄟ^消散細胞跨膜電勢、破壞細胞膜滲透性造成胞內(nèi)鉀離子泄漏，但不會明顯破壞細胞膜完整性，核酸等大分子物質(zhì)僅發(fā)生輕微泄漏。因此，推測細胞膜是糖酯發(fā)揮抑菌作用的一個主要靶點。