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(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

興化地處長(zhǎng)江中下游平原，土壤富含水分，特別適合龍香芋的生長(zhǎng)。央視《舌尖上的中國(guó)》欄目讓興化龍香芋走向了全國(guó)。興化龍香芋中淀粉含量達(dá)12.04 g/100 g，特別是鮮味氨基酸含量與氨基酸總量之比達(dá)到44%[1]。龍香芋醬是以龍香芋為主要原料釀制成的一種調(diào)味醬，和豆醬及面醬相比味更鮮。本試驗(yàn)研究了以興化龍香芋為主要原料用發(fā)酵法生產(chǎn)龍香芋調(diào)味醬的工藝和參數(shù)，并利用響應(yīng)面法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化[2]，以期為龍香芋醬的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

龍香芋(購(gòu)于興化垛田當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶家中)、米曲霉3042(沂水錦潤(rùn)生物科技有限公司)、食鹽及黃豆(均購(gòu)于泰州大潤(rùn)發(fā)超市)等。

1.2 儀器與設(shè)備

切丁機(jī)、HPX-9052MBE恒溫培養(yǎng)箱、EL3002電子天平(梅特勒-托利多)、蒸煮鍋、不銹鋼菜刀、削皮刀、砧板、不銹鋼盆、燒杯、溫度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

選料→清洗→去皮→切丁→配料→蒸煮→攤涼→接種→制曲→加鹽水→發(fā)酵→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 選料

選用250 g左右的新鮮興化龍香芋，要求大小均勻，形狀近似球形，無(wú)病蟲害。

1.3.2.2 清洗

用水將芋頭清洗干凈，沒(méi)有泥土或其他雜質(zhì)殘留。

1.3.2.3 去皮

用削皮刀削去芋頭表面褐色皮層，操作時(shí)需戴防護(hù)手套，以防芋頭表皮引起操作人員手上皮膚過(guò)敏。

1.3.2.4 切丁及配料

用不銹鋼菜刀把去皮后的龍香芋切分為1 cm3左右的芋頭丁，切分后立即放進(jìn)1%的鹽水中護(hù)色保存。將龍香芋丁與浸泡好的黃豆瓣以12∶5的干料比混合并攪拌均勻。

1.3.2.5 蒸煮及攤涼

將拌勻后的混合物料倒入蒸煮鍋內(nèi)，按料水比為1∶0.3的比例加水并攪拌均勻，通入蒸汽加熱至充滿蒸汽后，維持蒸汽2～2.5 min后出鍋[3]，攤涼冷卻至室溫。

1.3.2.6 接種及制曲[4，5]

按總干料質(zhì)量的0.8%接種米曲霉發(fā)酵劑，并混合拌勻后制曲，接種后的曲料需均勻松散地平鋪在曲床上，曲厚約5 cm，制曲室內(nèi)溫度控制在28～32 ℃，進(jìn)行通風(fēng)制曲。在接種后分別在14～16 h和19～21 h進(jìn)行2次翻曲，待曲料表面生長(zhǎng)出黃綠色的孢子，有曲香時(shí)出曲。

1.3.2.7 加鹽水及發(fā)酵

按總干料的90%～110%加入制醅鹽水，鹽水濃度在15%～20%，控制醬醪中食鹽濃度約為8%。置于恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵，每天翻醅1次，控制發(fā)酵溫度在35～45 ℃，發(fā)酵15～20天左右至醬醪成熟。發(fā)酵后檢測(cè)醬醪中游離氨基酸態(tài)氮含量(FAN值)的變化情況。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[6]

1.4.1 制曲工藝參數(shù)的確定

制曲是讓米曲霉在混合醬料中繁殖代謝，是保證龍香芋醬發(fā)酵的基本工序。通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，研究影響成品曲品質(zhì)制曲時(shí)的料水比、溫度和時(shí)間3個(gè)因素，以成品曲中蛋白酶的活力測(cè)定值為指標(biāo)，確定制曲的最佳工藝參數(shù)。

1.4.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)研究結(jié)果表明：發(fā)酵時(shí)的溫度、鹽水濃度和鹽水用量是對(duì)龍香芋醬發(fā)酵質(zhì)量影響最重要的3個(gè)因素，以龍香芋醬中游離氨基酸態(tài)氮含量(FAN值)為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析方法對(duì)龍香芋醬的發(fā)酵溫度、鹽水濃度和鹽水用量3個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定龍香芋醬的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)[7]。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)方法

采用標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999的福林法測(cè)定曲樣中蛋白酶的活力[8]。

采用標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.235-2016的酸度計(jì)法測(cè)定發(fā)酵后龍香芋醬成品中的游離氨基酸態(tài)氮(FAN)值[9]。

1.6 產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)

1.6.1 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

根據(jù)GB 2718-2014《釀造醬》的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)經(jīng)試驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝制作的龍香芋醬進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，具體檢測(cè)方法見(jiàn)表1。

表1 理化檢測(cè)方法Table 1 Physical and chemical detection methods

1.6.2 微生物指標(biāo)檢測(cè)方法

根據(jù)GB 2718-2014《釀造醬》的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)經(jīng)試驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝制作的龍香芋醬進(jìn)行微生物指標(biāo)檢測(cè)，具體檢測(cè)方法見(jiàn)表2。

表2 微生物檢測(cè)方法Table 2 Microbial detection methods

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲工藝條件的確定

2.1.1 料水比的確定

取預(yù)處理好的龍香芋丁和黃豆的混合料6份，按1(1∶0.2)，2(1∶0.25)，3(1∶0.3)，4(1∶0.35)，5(1∶0.4)，6(1∶0.45)的料水比加水拌料，經(jīng)蒸煮、冷卻后再按總干料0.8%的比例接種米曲霉后制曲。測(cè)定曲中蛋白酶的活力，研究采用不同料水比制曲時(shí)成品曲中蛋白酶活力的變化情況，見(jiàn)圖1。

圖1 料水比對(duì)成品曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of material-water ratio on the activity of finished protease

由圖1可知，采用不同料水比制成曲的蛋白酶活力差距非常顯著，在料水比為4(1∶0.35)時(shí)，成品曲中蛋白酶的活力在實(shí)驗(yàn)組中最高，因此制曲適宜的料水比初定為1∶0.35。

2.1.2 制曲溫度的確定

取預(yù)處理好的龍香芋丁和黃豆混合料6份，按1∶0.35的料水比加水拌料，經(jīng)蒸煮、冷卻后按總干料的0.8%接種米曲霉，分別在26，28，30，32，34，36 ℃溫度條件下制曲。分別測(cè)定各組曲中蛋白酶的活力，研究不同制曲溫度下蛋白酶活力的變化情況，見(jiàn)圖2。

圖2 制曲溫度對(duì)成品曲蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making temperature on the activity of finished protease

由圖2可知，在不同溫度下制曲，成品曲中蛋白酶活力變化較大，在制曲溫度為30 ℃的條件下，實(shí)驗(yàn)組中蛋白酶的活力最高，所以初步確定制曲溫度為30 ℃。

2.1.3 制曲時(shí)間的確定

取預(yù)處理好的龍香芋丁和黃豆混合料6份，按1∶0.35的料水比加水拌料，經(jīng)蒸煮、冷卻后再按總干料的0.8%接種米曲霉，在30 ℃條件下分別培養(yǎng)30，33，36，39，42，45 h進(jìn)行制曲。測(cè)定成品曲中蛋白酶的活力，研究在不同制曲時(shí)間內(nèi)成品曲中蛋白酶活力的變化情況，見(jiàn)圖3。

圖3 制曲時(shí)間對(duì)成品曲蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making time on the activity of finished protease

由圖3可知，不同制曲時(shí)間后，成品曲中蛋白酶的活力變化較大，在制曲時(shí)間為36 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中蛋白酶的活力最高，所以初步確定制曲時(shí)間36 h較適宜。

2.1.4 制曲最佳工藝參數(shù)的選擇

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取制曲料水比、制曲溫度及制曲時(shí)間3個(gè)因素的較優(yōu)工藝參數(shù)，以成品曲中蛋白酶的活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)制曲工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，篩選出最佳的制曲工藝參數(shù)[10]，因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test

由表4可知，因素中對(duì)蛋白酶活力的影響大小依次是A>C>B>D，即制曲料水比>制曲時(shí)間>制曲溫度>空列，根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，確定龍香芋醬制曲的最優(yōu)加工工藝為A2B3C2D2，即制曲料水比1∶0.35，制曲溫度32 ℃，制曲時(shí)間36 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，用此制曲工藝參數(shù)制備的龍香芋醬成品曲料中蛋白酶的活力達(dá)924 U/g。

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)龍香芋醬FAN值的影響

制備龍香芋醬時(shí)，按總制曲干料與鹽水1∶1的比例加入制醅鹽水，鹽水濃度為16%，發(fā)酵時(shí)間為18天，分別設(shè)定發(fā)酵溫度為36，38，40，42，44，46 ℃，按1.3.1及1.3.2的工藝要求制備龍香芋醬并測(cè)其FAN值。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)成品醬FAN值的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on FAN value of finished product

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時(shí)，F(xiàn)AN值接近最大值之后變化較小。因此，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，選擇適宜的發(fā)酵溫度為42 ℃。

2.2.2 鹽水濃度對(duì)龍香芋醬FAN值的影響

制備龍香芋醬時(shí)，按總制曲干料與鹽水1∶1的比例加入制醅鹽水，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時(shí)間18天，分別在鹽水濃度為15%，16%，17%，18%，19%，20%時(shí)，按1.3.1及1.3.2的工藝要求制備龍香芋醬并測(cè)其FAN值。

圖5 鹽水濃度對(duì)成品醬FAN值的影響Fig.5 Effect of brine concentration on FAN value of finished product

由圖5可知，當(dāng)鹽水濃度為15%時(shí)FAN值最大，但對(duì)15%的食鹽用量來(lái)說(shuō)，鹽水濃度過(guò)低，不能起到抑制雜菌的作用，龍香芋醬感官評(píng)價(jià)得到的風(fēng)味和貯藏性較差；而當(dāng)鹽水濃度為19%時(shí)，鹽水濃度過(guò)高，會(huì)抑制有益菌的生長(zhǎng)以及酶的作用，龍香芋醬風(fēng)味偏咸且香味偏淡。因此綜合考慮后，制備龍香芋醬時(shí)選用濃度為17%的鹽水。

2.2.3 鹽水用量對(duì)龍香芋醬FAN值的影響

制備龍香芋醬時(shí)，加入濃度16%的制醅鹽水，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時(shí)間18天，分別按總制曲干料與鹽水用量的比例為1(1∶0.8)，2(1∶0.9)，3(1∶1)，4(1∶1.1)，5(1∶1.2)，6(1∶1.3)時(shí)，按1.3.1及1.3.2的工藝要求制備龍香芋醬并測(cè)其FAN值。

圖6 鹽水添加量對(duì)成品醬FAN值的影響Fig.6 Effect of additive amount of brine on FAN value of finished product

由圖6可知，不同鹽水添加量對(duì)龍香芋醬FAN值的影響較大，在制曲干料與鹽水用量的比例為4(1∶1.1)時(shí)，龍香芋醬的FAN值最高。因此，選用1∶1.1的比例作為鹽水的添加量。

2.2.4 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，分別選取發(fā)酵溫度、鹽水濃度及鹽水用量中的較優(yōu)工藝參數(shù)，以龍香芋醬中氨基酸態(tài)氮含量(FAN值)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design Expert 軟件中的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法(response surface method，RSM)[11，12]，對(duì)影響FAN值的發(fā)酵溫度、鹽水用量及鹽水濃度進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化龍香芋醬的發(fā)酵工藝參數(shù)，因素水平編碼值見(jiàn)表5，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 響應(yīng)面因素水平表Table 5 The factors and levels of response surface

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiment

續(xù) 表

通過(guò)對(duì)龍香芋醬的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行分析，確定了發(fā)酵溫度、鹽水濃度及鹽水用量都是顯著因素。游離氨基酸態(tài)氮(FAN值)對(duì)發(fā)酵溫度、鹽水濃度及鹽水用量的二次回歸擬合方程：

FAN值(g/100 g)=0.73+0.017A-5.000E-003B-0.022C+5.000E-003AB-1.000E-002AC+0.015BC-0.073A2-0.038B2-0.093C2。

式中：A為發(fā)酵溫度，B為鹽水濃度，C為鹽水用量。

由表6可知，模型的P=0.0004，而失擬項(xiàng)的P=0.0662，說(shuō)明龍香芋醬的發(fā)酵工藝條件對(duì)FAN值的影響模型與實(shí)際情況擬合程度較好，可以預(yù)測(cè)龍香芋醬的發(fā)酵工藝參數(shù)。

表7 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 7 The variance analysis of regression equation

注：Prob>F<0.05，代表研究因素為顯著因素。

由方差分析結(jié)果可知，AB，AC和BC的交互作用都顯著，響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖7～圖9。

根據(jù)龍香芋醬發(fā)酵工藝條件的試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程各項(xiàng)的方差分析，由響應(yīng)面分析法優(yōu)化出制備龍香芋醬的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度42.8 ℃、鹽水濃度16.6%、鹽水用量1∶1.12。

圖7 發(fā)酵溫度A與鹽水濃度B的交互作用對(duì)龍香芋醬FAN值影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of interaction effect between fermentation temperature A and brine concentration B on FAN value of taro sauce

圖8 發(fā)酵溫度A與鹽水用量C的交互作用對(duì)龍香芋醬FAN值影響的響應(yīng)面Fig.8 Response of interaction effect between fermentation temperature A and brine dosage C on FAN value of taro sauce

圖9 鹽水濃度B與鹽水用量C的交互作用對(duì)龍香芋醬FAN值影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of interaction effect between brine concentration B and brine dosage C on FAN value of taro sauce

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)化出龍香芋醬最佳發(fā)酵工藝參數(shù)的可靠性，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，見(jiàn)表8。

表8 響應(yīng)面優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 8 Response surface optimized conditions verification test design table

由表8可知，試驗(yàn)4的龍香芋醬的FAN值最高，因此制備龍香芋醬的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度42.8 ℃、鹽水濃度16.6%、鹽水用量1∶1.12。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

隨機(jī)抽取20名食品生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生對(duì)龍香芋醬的感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，產(chǎn)品呈黃褐色或紅褐色，鮮艷有光澤；咸甜適口，醬香濃郁，無(wú)異味；粘稠適中，無(wú)雜質(zhì)。

2.3.2 理化檢測(cè)結(jié)果

理化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 理化檢測(cè)結(jié)果Table 9 Physicochemical test results

2.3.3 微生物檢測(cè)結(jié)果

微生物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 微生物檢測(cè)結(jié)果Table 10 Microbial test results

由表9和表10可知，產(chǎn)品感官、理化及微生物指標(biāo)均符合GB 2718-2014《釀造醬》衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，經(jīng)響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝，確定了龍香芋頭醬的最佳制曲工藝條件為曲料水比1∶0.35、制曲溫度32 ℃、制曲時(shí)間36 h。以成品醬中的游離氨基酸態(tài)氮(FAN)含量為評(píng)價(jià)依據(jù)，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化工藝并經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度42.8 ℃、鹽水濃度16.6%、鹽水用量1∶1.12，經(jīng)此工藝條件生產(chǎn)的龍香芋醬中的FAN值達(dá)到0.75 g/100 g。