張東鎖，臧 珊，胡勝武，郭 媛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

油菜是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是中國最重要的油料作物，含有豐富的油脂及蛋白質(zhì)，是現(xiàn)代重要的食用油和工業(yè)油來源[1]。甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus, AACC, 2n=38)是由二倍體親本白菜(Brassicarapa, AA, 2n=20)和甘藍(lán)(Brassicaoleracea, CC, 2n=18)天然雜交后染色體組加倍得到的異源四倍體物種[2]。甘藍(lán)型油菜起源于歐洲，于20世紀(jì)30至40年代分別由歐洲和日本引入中國，目前已經(jīng)成為中國油菜的主要栽培類型[3]。甘藍(lán)型油菜雜種優(yōu)勢顯著，雜種優(yōu)勢的幅度可以達(dá)到30%～60%[4]，雜交育種是油菜新品種選育的主要途徑，育種材料的遺傳變異和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究對(duì)于選擇親本材料，合理選配雜交組合非常關(guān)鍵。目前，多種細(xì)胞標(biāo)記、生物化學(xué)(同工酶)標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記(SSR、SRAP、AFLP等)等技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于作物遺傳多樣性的研究[5]，然而，在育種的實(shí)施過程中，選育的品種往往要具備很多的符合生產(chǎn)實(shí)踐的重要性狀，表型性狀的鑒定和描述仍然是檢驗(yàn)遺傳變異最基本的方法和途徑[6]。全面分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性模式，不僅需要從基因?qū)用嫣接懫涠鄻有?，同時(shí)也需要表型多樣性的數(shù)據(jù)[7]。前人已經(jīng)對(duì)小麥[8]、大麥[9]、番茄[10]、茶樹[11]等作物的表型多樣性進(jìn)行了研究，并在揭示表型變異規(guī)律和分類方面取得了有價(jià)值的結(jié)果。對(duì)于油菜育種者而言，育種過程中的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀至關(guān)重要[1]。陳衛(wèi)江等[12]利用株高、單株總莢數(shù)、千粒質(zhì)量等10個(gè)農(nóng)藝性狀對(duì)24份甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系和恢復(fù)系親本進(jìn)行了遺傳距離測定分析，并對(duì)雜交親本的遺傳距離與雜種優(yōu)勢的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，親本遺傳距離與雜種優(yōu)勢間存在一定程度的正相關(guān)。Hu等[13]利用9個(gè)農(nóng)藝性狀對(duì)國內(nèi)外的63份甘藍(lán)型油菜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以明顯的將中國和歐洲的甘藍(lán)型油菜劃分為兩大類，為拓展國內(nèi)資源提供了理論依據(jù)。K?rber等[14]利用518份甘藍(lán)型油菜自交系研究了幼苗發(fā)育的多樣性及其與農(nóng)藝性狀間的關(guān)系，在8種檢測的種質(zhì)類型中發(fā)現(xiàn)了表型多樣性的差異。Chen等[15]對(duì)世界各地搜集到的488份甘藍(lán)型油菜核心種質(zhì)的表型性狀進(jìn)行了評(píng)估，分析12個(gè)產(chǎn)量與農(nóng)藝性狀、10個(gè)品質(zhì)性狀的遺傳變異，該信息為育種親本的選擇提供了有用的支撐。此外，該研究挖掘到多份優(yōu)異基因資源和特異遺傳材料，可直接用于生產(chǎn)和遺傳研究。

本試驗(yàn)對(duì)30份甘藍(lán)型油菜三系骨干親本材料的11個(gè)農(nóng)藝和品質(zhì)性狀進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，劃分育種骨干親本的雜種優(yōu)勢群，旨在為油菜雜交育種的親本選配和生產(chǎn)利用等提供有效的信息和重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的甘藍(lán)型油菜骨干親本材料共有30份，包括15份恢復(fù)系和15份保持系材料(基于Pol/Shaan2A CMS分類的恢保關(guān)系)，均為低芥酸和低硫苷材料(表1)。這些材料包括‘秦優(yōu)7號(hào)’‘秦油10號(hào)’‘陜油8號(hào)’‘陜油803’等審定油菜雜交種的父本，或中雙系列、浙雙系列等常規(guī)油菜品種的高代選系。以上材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心生物技術(shù)育種課題組提供。

表1 供試油菜品種編號(hào)、來源、類型和品質(zhì)Table 1 Code, origin, type and quality of rapeseed accessions

注：“00”代表低芥酸，低硫苷。類型代表基于Pol/Shaan2A CMS分類的恢保關(guān)系。

Note:“00” represents low content of erucic acid and low content of glucosinolates. Type represents restorers and maintainers of Pol/Shaan2A CMS.

試驗(yàn)于2016至2017年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院標(biāo)本區(qū)(北緯34°16′，東經(jīng)108°)試驗(yàn)地進(jìn)行，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)株系種植5行，行長2.0 m，行間0.50 m，植株間距0.15 m，每行15～20株，四周設(shè)置保護(hù)行，土壤肥力中等，其他田間管理按常規(guī)進(jìn)行。

1.2 農(nóng)藝和品質(zhì)性狀調(diào)查

成熟期在每小區(qū)中部隨機(jī)選擇5株進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查記載的性狀包括：株高(PH)、分枝部位(SPFPB)、一次有效分枝數(shù)(NB)、主花序有效長度(LTM)、主花序有效角果數(shù)(NSTR)、單株角果數(shù)(NSP)、每角粒數(shù)(NS)、角果長度(SL)、千粒質(zhì)量(TSW)和單株產(chǎn)量(SYP)10個(gè)相關(guān)性狀。收獲種子后，參照文獻(xiàn)[16]的方法，利用近紅外儀(Foss NIR Systems Inc, Denmark)對(duì)小區(qū)混合種子進(jìn)行含油量(OC)測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11.0軟件[17]的單因素方差分析(One Way ANOVA)程序?qū)謴?fù)系和保持系的11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行比較。單株產(chǎn)量為理論值，由全株有效角果數(shù)、每角粒數(shù)、千粒質(zhì)量的乘積得來。對(duì)每個(gè)小區(qū)下的株高、分枝部位、一次有效分枝數(shù)、主花序有效長度、主花序有效角果數(shù)，單株角果數(shù)、每角粒數(shù)、角果長度、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量和含油量等11個(gè)性狀的原始數(shù)據(jù)用Excel整理后，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的方差分析(Analysis of Agronomic and Quality Variance，AAQVA)，11個(gè)性狀的平均值用于聚類分析。根據(jù)馬氏距離計(jì)算材料間的成對(duì)距離。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)各項(xiàng)平均值進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析；聚類分析采用Ward’s法(離差平方和法)[18]進(jìn)行系統(tǒng)聚類。所有材料的主成分都是從相關(guān)系數(shù)中提取出來的。利用DPS軟件對(duì)11個(gè)性狀進(jìn)行有效矩陣分析。用SPSS11.0軟件的散點(diǎn)圖繪制前2個(gè)主成分的坐標(biāo)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差結(jié)果分析

30份參試甘藍(lán)型油菜被分成2組，一組為恢復(fù)系材料，一組為保持系材料。對(duì)11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的方差分析(AAQVA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)：在恢復(fù)系材料中，11個(gè)農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小依次為單株產(chǎn)量、分枝部位、單株角果數(shù)、角果長度、主花序有效角果數(shù)、每角粒數(shù)、一次有效分枝數(shù)、主花序有效長度、千粒質(zhì)量、含油量、株高，說明供試材料在恢復(fù)系材料差異在單株產(chǎn)量、分枝部位、單株角果數(shù)等性狀上變異豐富，在千粒質(zhì)量、含油量、株高方面差異小。除株高和含油量變異系數(shù)分別為8.09%和8.33%外，其余性狀變異系數(shù)都在10%以上，最大為單株產(chǎn)量，其變異系數(shù)為33.57%。在保持系材料中，11個(gè)農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)大小與恢復(fù)系的基本一致，最大為單株產(chǎn)量(39.65%)，最小為株高(6.87%)。然而，所有測試性狀在恢復(fù)系與保持系上沒有顯著性差異(表2和表3)。

表2 恢復(fù)系與保持系11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 2 The basic statistic data of 11 agronomic and quality traits between restorer and maintainer lines

注：PH.株高;SPFPB.分枝部位；NB.一次有效分枝數(shù);LTM.主花序有效長度;NSTR.主花序有效角果數(shù);SL.角果長度;NSP.單株角果數(shù);NS.每角粒數(shù);TSW.千粒質(zhì)量;SYP.單株產(chǎn)量;OC.含油量。

Notes:PH.plant height;SPFPB.setting position of the first primary branch;NB.number of primary branches per plant;LTM.length of terminal raceme;NSTR:number of siliques of terminal;SL.siliques length;NSP.number of siliques per plant;NS.number of seed per silique;TSW.thousand seed mass;SYP.seed yield per plant;OC.oil content.

表3 恢復(fù)系與保持系11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的變異系數(shù)Table 3 The variation coefficient of 11 agronomic and quality traits between restorer and maintainer lines %

2.2 聚類分析

根據(jù)11個(gè)農(nóng)藝性狀的原始數(shù)據(jù)，利用Ward’s最小方差方法對(duì)30份油菜供試材料進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建聚類圖(圖1)。當(dāng)遺傳距離的臨界值為39.73時(shí)，將30份參試材料分為三大類(Cluster Ⅰ～Ⅲ)：Cluster Ⅰ包括16個(gè)材料，其中12個(gè)為恢復(fù)系，如Q10C、QY211R、Z821R、S11R、QSC等；4個(gè)為保持系，2010B7、New B1、Zhong 5和Zhong 9。Cluster Ⅱ包括10個(gè)材料，其中7個(gè)為保持系，如2012B1、H15、Zhong 7等；3個(gè)為恢復(fù)系，HYZ01R、2000-5R和D1526。Cluster Ⅲ包括4個(gè)材料，ZY72、Zhong 2、ZY18和CZ49，均為保持系。結(jié)果說明，參試恢復(fù)系和保持系材料間存在一定的遺傳差異。

2.3 主成分分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)11個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行有效矩陣分析，并繪制散點(diǎn)圖(圖2)。PCA結(jié)果表明，PC1占總變異的27.38%，PC2占總變異的22.11%。PC1和PC2的公式如下：

PC1=-0.2915X1+0.0697X2-0.0518X3+0.2405X4+0.2628X5+0.4878X6+0.3515X7+0.0599X8+0.2755X9+0.2510X10+0.5258X11

PC2=0.3015X1+0.4600X2+0.3322X3+0.3259X4-0.2079X5+0.1214X6+0.3622X7-0.3332X8-0.3294X9-0.2587X10+0.0730X11

主成分分析(PCA)結(jié)果與聚類分析結(jié)果相似。從PCA分析結(jié)果(圖2)中可以看出，30份材料主要被劃分為3大類。除Zhong 5(No.17)、2010B1(No.21)、H15(No.22)與2010B7(No.24)4個(gè)材料外，其余11個(gè)恢復(fù)系材料都被劃為一起，與在聚類分析結(jié)果(Cluster Ⅰ)基本一致；大部分保持系材料也被劃在一起；Q10C(No.1)、Zhong 9 Ⅲ(No.19)和CZ49(No.29)3個(gè)材料在聚類分析中歸為第3類。

圖1 基于農(nóng)藝性狀構(gòu)建的30份油菜材料的聚類Fig.1 Dendrogram of 30 rapeseed materials generated by agronomic traits

圖2 從30份油菜材料的11個(gè)農(nóng)藝性狀中提取的前2個(gè)主成分坐標(biāo)圖Fig.2 Bioplot of first two major principal components extracted from 11 agronomic traits of 30 rapeseed accessions

2.4 甘藍(lán)型油菜保持系和恢復(fù)系親本間農(nóng)藝性狀差異分析

外部形態(tài)特征的變異在一定程度上反映了遺傳變異的大小。由表4可以看出，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)變異系數(shù)為86.40%，保持系和恢復(fù)系材料間僅為13.60%。由表5可以看出，保持系內(nèi)差異最大為15.35%，恢復(fù)系內(nèi)差異次之為7.46%，保持系與恢復(fù)系間差異最小為1.80%。總體來說，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異。

表4 恢復(fù)系與保持系油菜農(nóng)藝性狀變異分析Table 4 Analysis of agronomic traits variance of rapeseed accessions of restorer and maintainer

表5 不同甘藍(lán)型油菜親本品種間的差異分析Table 5 Pairwise differences of population average

注：對(duì)角線數(shù)據(jù)為區(qū)內(nèi)成對(duì)材料差異的平均值；對(duì)角線下數(shù)據(jù)為修正后的區(qū)間差異平均值。

Note:Diagonal elements:average number of pairwise differences within population(PiX);below diagonal:corrected average pairwise difference(PiXY-(PiX+PiY)/2).

3 討 論

油菜骨干親本的遺傳多樣性分析是雜交育種和雜種優(yōu)勢利用的重要基礎(chǔ)工作。甘藍(lán)型油菜種植歷史較短，中國現(xiàn)有的甘藍(lán)型油菜的原始資源大多來源于歐洲和日本，導(dǎo)致遺傳背景相對(duì)比較狹窄，品種間遺傳多樣性普遍不高，可利用資源匱乏[19]。

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是指通過觀察或者簡單的儀器測量獲得的性狀，為作物種質(zhì)資源的分類和多樣性分析提供了基本依據(jù)[6]。農(nóng)藝性狀具有表現(xiàn)直觀、便于識(shí)別、易于掌握以及與生產(chǎn)直接相關(guān)等特點(diǎn)，因而在種植資源的分類、育種親本材料的選擇、組配、以及育成品種的識(shí)別上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。謝永俊等[20]對(duì)收集到的15個(gè)國家的225份甘藍(lán)型油菜的農(nóng)藝性狀以及含油量等進(jìn)行評(píng)估與分析，篩選出22份優(yōu)異國外種質(zhì)資源，并在此基礎(chǔ)上選育出了11個(gè)優(yōu)質(zhì)油菜新品種。Tian等[21]利用農(nóng)藝性狀對(duì)96份油菜材料進(jìn)行了地理位置的聚類，結(jié)果表明：96份甘藍(lán)型油菜可以聚類到3個(gè)地理位置上。高必軍等[22]對(duì)甘藍(lán)型油菜的主要農(nóng)藝性狀與單株產(chǎn)量的關(guān)系進(jìn)行了分析，方差分析結(jié)果表明：試驗(yàn)所測定的油菜單株產(chǎn)量等10個(gè)性狀在38個(gè)參試品種間存在顯著差異。本研究選擇本課題組多年選育成功的30份油菜三系骨干親本株系，包括15份保持系和15份恢復(fù)系甘藍(lán)型油菜，利用聚類分析、主成分分析及方差分析對(duì)它們11個(gè)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：參試親本材料間存在一定的遺傳差異，大部分保持系和恢復(fù)系材料被分開，同時(shí)，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異。

形態(tài)標(biāo)記雖易觀察、操作方便，但表型數(shù)量較少，易受環(huán)境和作物生育階段的影響；而DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境影響和基因表達(dá)的時(shí)空影響，遺傳標(biāo)記數(shù)量多，遍布整個(gè)基因組，穩(wěn)定性好，多態(tài)性明顯。因此，將形態(tài)學(xué)性狀為主的表型分析與分子標(biāo)記或其它方式相結(jié)合，已經(jīng)成為目前研究種植資源的有效手段[23]。何余堂等[23]通過形態(tài)學(xué)鑒定和RAPD分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，對(duì)不同地理來源的82份白菜型油菜(B.campestrisL.)資源進(jìn)行了分析，揭示了白菜型油菜在中國的起源與進(jìn)化。蒲曉斌等[24]對(duì)73份西南地區(qū)芥菜型油菜資源遺傳多樣性進(jìn)行了分析，基于15個(gè)植物學(xué)性狀測量數(shù)據(jù)的聚類分析將其分為4大類，共14個(gè)亞類；RAPD標(biāo)記多態(tài)性分析結(jié)果的聚類分析顯示為3大類，共15個(gè)亞類，結(jié)果表明西南地區(qū)芥菜型油菜資源具有豐富的遺傳多樣性，聚類結(jié)果主要遵循地域和生態(tài)環(huán)境規(guī)律。Ana等[25]通過利用表型數(shù)據(jù)及RAPD標(biāo)記對(duì)30份冬油菜品種進(jìn)行了遺傳多樣性的評(píng)估。對(duì)本研究供試材料，臧珊[26]利用SSR和SRAP分子標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了研究。對(duì)農(nóng)藝性狀和SSR/SRAP分子標(biāo)記遺傳多樣性結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，二者存在一定的一致性，兩種方法都可以將供試材料聚類為3類，大部分保持系和恢復(fù)系材料被分開，群體內(nèi)部遺傳變異大于群體間的遺傳變異。同時(shí)，二者也存在一定的差異，表型聚類中，第Ⅰ類16個(gè)材料在分子標(biāo)記中仍有13個(gè)被聚在同一類，第Ⅱ類10個(gè)材料在分子標(biāo)記中仍有6個(gè)被聚在同一類?？梢姡?種聚類方法中被聚在同一類的材料居多。其次，2種方法都發(fā)現(xiàn)保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異，目前，不同于玉米，油菜中雜種優(yōu)勢群劃分和雜優(yōu)模式研究開展的較少[27-29]，這可能是導(dǎo)致油菜保持系和恢復(fù)系之間遺傳差異較少的原因，因此，需要加強(qiáng)該方面的研究，定向擴(kuò)大遺傳差異。綜上，表型性狀和分子標(biāo)記對(duì)油菜三系骨干親本的遺傳多樣性的鑒定存在一定的差異，但表現(xiàn)更多的是一致性，以上研究結(jié)果建立了對(duì)供試骨干親本的整體認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)，對(duì)育種設(shè)計(jì)、材料創(chuàng)制和選擇、雜交組合選配具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。