Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化中的作用及機(jī)制

李丹 王黙 紀(jì)元 王瑋 袁曉燕

作者單位：264200 威海市立醫(yī)院檢驗科(李丹，紀(jì)元，王瑋，袁曉燕)；250021山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科(王默)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。谥袊l(fā)病率為(1 ～2)/10萬人，其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未清楚。MS最常見的類型是復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS)。目前，輔助性T細(xì)胞(T helper cell 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Treg)細(xì)胞在免疫性疾病、腫瘤性疾病和感染性疾病研究較多，但對RRMS患者的研究相對很少，本文通過對31例RRMS患者靜脈血Th17/Treg細(xì)胞百分率及相關(guān)細(xì)胞因子水平的檢測，深入研究Th17/Treg細(xì)胞在RRMS發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 對象和方法

1.1對象選取2014-01—2017-08期間威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院RRMS患者(RRMS組)31例，男8例、女23例；年齡26～48歲，平均年齡(37±11)歲，均為急性發(fā)作期，入院前3個月未使用免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素，均符合2005年修訂的McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，并剔除：合并其他自身免疫性疾病、嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能不全、急慢性感染、腫瘤和合并妊娠患者。 入院時EDSS評分2.5～8.0分，平均(6.31±1.54)分，病程3個月至5年，平均(30.41±4.85)個月。31例RRMS患者均存在新發(fā)陽性癥狀和(或)體征，其中感覺異常12例，肢體無力10例，視力減退5例，共濟(jì)失調(diào)4例，同時存在兩種或兩種以上癥狀者19例；頭顱MRI檢查均出現(xiàn)新的增強(qiáng)病灶。

另外選取同期神經(jīng)系統(tǒng)非炎性患者29例為對照組，包括偏頭痛患者19例，緊張性頭痛患者10例，男15例、女14例，年齡25～45歲，平均年齡(35±10)歲，該組患者頭顱CT或MRI均正常；腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫性疾病、急慢性感染、并發(fā)嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全者，半年內(nèi)接受免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素或其他免疫治療。

兩組在性別和年齡方面兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2主要儀器與試劑流式細(xì)胞儀采用美國BD 公司FACSCalibur型號，鼠抗人CD4-APC和FOXP3-PE抗體購自美國BD公司，鼠抗人IL-17A-FITC抗體購自eBiocience公司，淋巴細(xì)胞分離液、佛波酯乙醇、離子霉素和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素均購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒購自R&D公司。

1.3方法

1.3.1治療方法：RRMS組患者入院后靜脈滴注甲潑尼龍1000 mg/d沖擊治療，3 d后減量至500 mg/d，每3 d劑量減半，至30 mg時改為潑尼松口服35 mg/d，每周減量5 mg直至停藥。

1.3.2標(biāo)本采集：RRMS組治療前和對照組于入院后采集標(biāo)本，另外RRMS組在甲潑尼龍治療2周后再次采集標(biāo)本設(shè)為治療后組。

所有研究對象均于清晨空腹采集肘靜脈血5 mL置肝素于抗凝管中，其中3 mL血液標(biāo)本進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，2 mL血標(biāo)本離心后留取血漿置EP管中保存在于-80低溫冰箱中備用。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測Th17和Treg細(xì)胞百分率：向BD離心管中加入3 mL血液標(biāo)本和等體積PBS稀釋液，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞。向BD離心管中加入10 mg/L的布雷菲德菌素A、1 mg/L的離子霉素和0.02 mg/L的佛波酯，于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))2CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。以3000r/min(離心半徑13.5 cm) 離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取細(xì)胞懸液300 μL，加入10 μL CD4-APC抗體，室溫避光孵育30 min，4%(質(zhì)量濃度L)多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌后離心棄上清，加破膜緩沖液作用10 min。測定管中加入相應(yīng)的IL-17A-FITC和FOXP3-PE抗體各10 μL，對照管中加入相應(yīng)的同型對照，室溫避光孵育30 min，以PBS充分洗滌，加300 μL 1%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定，上機(jī)檢測，以CD4+T 細(xì)胞射門，Th17細(xì)胞百分率即檢測CD4+IL-17+雙陽細(xì)胞所占的百分比，Treg細(xì)胞百分率即檢測CD4+FOXP3+雙陽細(xì)胞所占百分比，每份標(biāo)本采集的細(xì)胞數(shù)≥20 000個，采用CellQuest分析軟件分析Th17和Treg細(xì)胞百分率。

1.3.4ELISA法檢測血漿細(xì)胞因子：嚴(yán)格按照R&D公司酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書要求檢測血漿中IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35和TGF-β水平。分別比較RRMS組治療前與對照組、RRMS組甲潑尼龍治療前后上述各因子水平，并分析RRMS 組患者治療前Th17細(xì)胞百分率與上述各因子水平的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 18.0軟件包對進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗分析。Th17細(xì)胞與IL-17、IL-23、IL-35、IL-6、IL-10及TGF-β水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RRMS組治療前后EDSS評分比較RRMS組治療前EDSS評分為(6.31±1.54)分，高于治療后〔(4.02±0.68)分〕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.75，P<0.05)。

2.2兩組患者外周血Th17和Treg細(xì)胞百分率比較RRMS組治療前Th17細(xì)胞百分率〔(15.24±2.54)%〕明顯高于對照組〔(3.12±1.27)%〕(t=0.91，P<0.05)，而Treg細(xì)胞百分率〔(11.12±3.13)%〕明顯低于對照組〔(35.04±4.21)%〕(t=-0.93，P<0.05)，Th17/Treg比例，與對照組(0.10±0.02)相比，RRMS組治療前(1.51±0.62)也明顯升高。與RRMS組治療前〔(15.24±2.54)%〕相比，甲潑尼龍治療后Th17細(xì)胞百分率〔(4.24±1.14)%〕明顯降低(t=0.88，P<0.05)；與RRMS組治療前〔(11.12±3.13)%〕相比，治療后Treg細(xì)胞百分率〔(23.14±2.86)%〕明顯升高(t=-0.79，P<0.05)；Th17/Treg比例，與RRMS組治療前(1.51±0.62)相比，甲潑尼龍治療后(0.19±0.07)顯著降低(t=0.95，P<0.01)(圖1)。

圖1 三組患者外周血Th17/Treg細(xì)胞FCM圖

表1 RRMS組治療前與對照組血漿IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35 和 TGF-β水平比較

表2 RRMS組患者治療前后血漿IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35 和 TGF-β水平比較

2.3RRMS組治療前與對照組血漿IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35和TGF-β水平比較RRMS組治療前IL-17A、IL-23、IL-6和IL-10水平均明顯高于對照組(P<0.05；P<0.01)，而IL-35 和 TGF-β水平顯著低于對照組(分別P<0.05、P<0.01)。具體見表1。

2.4RRMS組患者治療前后血漿IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35和TGF-β水平比較與治療前比較，RRMS組治療后IL-17A、IL-23和IL-6水平明顯降低(P<0.05)，IL-35和TGF-β水平明顯升高(P<0.05；P<0.01)，IL-10水平兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體見表2。

2.5RRMS組Th17細(xì)胞百分率與IL-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35和TGF-β水平的相關(guān)分析Th17細(xì)胞百分率與IL-17A(r=0.89，P=0.002)、IL-23(r=0.71，P=0.038)和IL-6(r=0.83，P=0.021)水平呈正相關(guān)，與IL-35(r= -0.82，P=0.001)和TGF-β(r=-0.74，P=0.042)水平呈負(fù)相關(guān)；與IL-10水平無相關(guān)性(r=0.31，P=0.058)。

3 討論

過去普遍認(rèn)為，傳統(tǒng)的Th1/Th2細(xì)胞失衡是MS的重要免疫發(fā)病機(jī)制，隨著研究不斷深入，Th1/Th2細(xì)胞失衡不能很好地解釋MS這類自身免疫性疾病的發(fā)生。近年來Th17/Treg細(xì)胞成為自身免疫性疾病中的研究熱點(diǎn)，Th17和Treg細(xì)胞是兩類獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞，在IL-6和TGF-β共同作用下初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，在僅有TGF-β的情況下向Treg細(xì)胞分化。Th17細(xì)胞活化后產(chǎn)生IL-17、IL-21、IL-23、IL-6、IL-29和TNF-α等多種細(xì)胞因子(以IL-17A為主)，這些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞炎性浸潤和組織破壞[2]， 引起自身免疫性疾病的發(fā)生。已有研究表明在MS動物模型自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠外周血中Th17細(xì)胞百分率明顯升高[3]。于周等[4]的研究表明在MS患者外周血中CD4+IL-17+T細(xì)胞比例顯著高于對照組，且外周血清中IL-17和IL-23水平也明顯升高。梁君利等[5]的研究表明在RRMS患者病灶中IL-17轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且腦脊液中IL-17表達(dá)明顯高于健康對照組。本研究發(fā)現(xiàn)RRMS患者Th17細(xì)胞百分率高于對照組，血清中Th17細(xì)胞的三種功能蛋白IL-17A、IL-23和IL-6表達(dá)水平顯也具有相同的變化趨勢，且這三種細(xì)胞因子水平均與Th17細(xì)胞百分率呈正相關(guān)性，可以間接證明IL-6在Th17細(xì)胞分化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。IL-23是在Th17細(xì)胞分化起始后的存活、功能維持及介導(dǎo)免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可或缺的作用[6]，研究結(jié)果初步提示Th17及相關(guān)因子的高表達(dá)參與了RRMS的發(fā)生過程，但其具體的機(jī)制還有待深入研究。

Treg細(xì)胞是近幾年發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)大免疫抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞型之一，業(yè)已證明，F(xiàn)oxp3+Treg可以調(diào)節(jié)機(jī)體對外源性抗原免疫反應(yīng)的程度，其數(shù)量減少和功能失調(diào)與多種疾病如自身免疫性疾病、過敏性疾病、感染性疾病等密切相關(guān)，它主要是通過細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如IL-35、IL-10和TGF-β等發(fā)揮負(fù)性的免疫調(diào)節(jié)作用。有研究表明，Treg細(xì)胞抑制Th17細(xì)胞分化是通過其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3發(fā)揮作用，或是通過下調(diào)細(xì)胞因子IL-17和IL-23的表達(dá)抑制Th17細(xì)胞分化[7]。周冬亮等[8]的研究中發(fā)現(xiàn)MS患者外周血中Treg細(xì)胞減少、功能降低， 受Treg細(xì)胞負(fù)調(diào)控的Th17細(xì)胞增加， Th17細(xì)胞和DC細(xì)胞分泌的促炎因子誘發(fā)一系列自身免疫級聯(lián)反應(yīng)， 最終導(dǎo)致髓鞘脫失和軸突損害， 引發(fā)一系列MS臨床癥狀。Jamshidian 等[9]研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞百分率和Treg/Th17比值與MS的臨床癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)RRMS組外周血Treg細(xì)胞百分率明顯低于對照組， ELISA檢測Treg細(xì)胞功能蛋白發(fā)現(xiàn)IL-35和TGF-β水平明顯降低，且兩者與Th17細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)，可能是IL-35參與抑制FOXP3的表達(dá)進(jìn)而使Treg細(xì)胞免疫功能下降[10]。RRMS組IL-10水平顯著升高，與Th17細(xì)胞百分率無相關(guān)性，原因可能是IL-10雖然是Treg細(xì)胞的功能蛋白，但并不是僅由Treg細(xì)胞分泌，Th2和Th9細(xì)胞也可以大量分泌IL-10，故當(dāng)RRMS時Treg細(xì)胞分泌IL-10減少，但Th2 和Th9細(xì)胞仍然可以大量分泌IL-10，所以發(fā)生RRMS時IL-10水平是升高的；也有可能是因為IL-10是炎性抑制因子，當(dāng)發(fā)生RRMS炎性反應(yīng)時，IL-10反應(yīng)性增高，具體的原因還有待深入研究。另外，甲潑尼龍治療急性期RRMS起效快，效果良好，治療后EDSS評分明顯降低，Th17細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，Treg細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，糾正Th17/Treg失衡，同時相關(guān)的功能蛋白也發(fā)生相應(yīng)改變，其機(jī)制可能是因為甲潑尼龍作為一種合成的糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎和抗過敏作用，抑制RRMS患者Th17細(xì)胞的炎性反應(yīng)。有研究報道證實甲潑尼龍沖擊治療RRMS患者使其血清中IL-23和IL-17水平降低。也有報道稱甲潑尼龍沖擊治療RRMS患者后，CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯升高，TNF-α和干擾素-γ水平減低，IL-10水平升高。正常生理情況下Th17和Treg細(xì)胞之間相互拮抗和制約，維持兩者的生理平衡是機(jī)體抗感染免疫和自身免疫耐受的重要機(jī)制，而甲潑尼龍是通過抑制Th17細(xì)胞的炎性反應(yīng)，還是通過上調(diào)Treg細(xì)胞，恢復(fù)其功能來抑制Th17細(xì)胞的炎性反應(yīng)，或是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平來改善病情，還是幾種機(jī)制協(xié)同存在發(fā)揮作用仍有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究結(jié)果顯示，RRMS的發(fā)生與Th17/Treg比例失衡關(guān)系密切，且在RRMS的發(fā)生發(fā)展中，Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子相互協(xié)同或制約發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，希望在今后的科研及臨床工作中，研究者們可以以此為切入點(diǎn)，能為RRMS患者提供更有效、更精準(zhǔn)的治療方法。