韋雷 黃琪 曾春梅 吳月娟 董樂 吳原

作者單位：530021 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

丁苯酞(Dl-3-n-butylphthalide，NBP)是從芹菜籽中分離出的一種有效成分，其化學(xué)名是消旋-3-正丁基苯酞，是我國(guó)第3個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物，目前主要應(yīng)用于缺血性腦卒中的治療。大量研究證實(shí)NBP可阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)[1-2]，可有效改善線粒體功能，通過對(duì)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑影響細(xì)胞的狀態(tài)[3-5]。作者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，NBP可通過抗凋亡途徑保護(hù)神經(jīng)髓鞘的完整性[6]，但具體療效及機(jī)制仍不明確。本研究通過觀察NBP對(duì)溴化乙錠(ehidium bromide，EB)誘導(dǎo)的脫髓鞘大鼠胼胝體B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 asociated X potein，Bax)表達(dá)的影響，旨在初步探討NBP對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為NBP的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性SD大鼠18只，9～10周齡，體重220～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，室溫控制在22～25 ℃，自然光照，自由進(jìn)食和飲水。將大鼠隨機(jī)分為模型組、治療組、對(duì)照組，每組6只。

1.2主要試劑及儀器EB購自Sigma-Aldrich公司，NBP注射液(規(guī)格：25 mg：5 mL)購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，Luxol blue solution染色液購自北京索萊寶科技有限公司，Bcl-2、Bax多克隆抗體購自Abcam公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，腦立體定位儀購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，10 μL微型進(jìn)樣器購自上海高鴿工貿(mào)有限公司。

1.3方法

1.3.1脫髓鞘大鼠模型制備：腹腔注射10 %(質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉大鼠后固定于腦立體定位儀上，采用10 μL微型進(jìn)樣器以0.05 μL/min速度給予模型組及治療組大鼠注射5 μL 0.05%(質(zhì)量濃度)EB至右側(cè)側(cè)腦室(AP：-1.0 mm；ML：+2.0 mm；DV：+3.5 mm)[7]，對(duì)照組大鼠以同樣方法注入等體積生理鹽水。第2天起治療組于每天上午10時(shí)按體質(zhì)量30 mg/(kg·d)腹腔注射NBP注射液，共10 d。模型組、對(duì)照組腹腔以同法注射等量生理鹽水。

1.3.2取材及石蠟切片制備：大鼠經(jīng)腹腔注射10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉，打開胸腔暴露心臟，灌注針經(jīng)左心室達(dá)升主動(dòng)脈處固定，剪開左心耳，快速灌注生理鹽水，待左心耳流出液體變清亮后改用 4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注，當(dāng)大鼠肝臟及四肢變硬后完成灌注。將大鼠斷頭取腦置于4%(質(zhì)量濃度) 多聚甲醛進(jìn)行后固定。常規(guī)石蠟包埋，沿側(cè)腦室注射進(jìn)針部位附近進(jìn)行5 μm連續(xù)冠狀位切片備用。

1.3.3HE染色：取石蠟切片常規(guī)脫蠟、水洗；蘇木素染色5 min后水洗，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸酒精分化5 s，返藍(lán)10 min，伊紅染色1 min后水洗；常規(guī)脫水、透明、封片；在光學(xué)顯微鏡(10×20放大倍數(shù))下觀察胼胝體形態(tài)學(xué)改變并采集圖片 。

1.3.4LFB髓鞘染色：取石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水洗；95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇漂洗；加入Luxol blue solution染色液，室溫過夜；加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗去多余染色液，蒸餾水沖洗；加入Luxol分化液分色15 s；加入70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分色30 s至灰白質(zhì)清晰，蒸餾水沖洗；伊紅染色1 min后水洗；常規(guī)脫水、透明、封片；在光學(xué)顯微鏡(10×20放大倍數(shù))下觀察胼胝體脫髓鞘程度并采集圖片。取每張切片脫髓鞘最明顯的視野，運(yùn)用IPP軟件計(jì)算髓鞘脫失率，并取平均值表示。髓鞘脫失率(%)=髓鞘脫失面積/該視野下胼胝體面積×100%。

1.3.5Bcl-2和Bax表達(dá)水平檢測(cè)：采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水洗；入0.01 mol/L(pH 6.0)枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，高壓修復(fù)10 min后自然冷卻，用PBS液漂洗3次；加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O215 min，PBS液漂洗3次；室溫下血清封閉30 min；滴加一抗(Bcl-2濃度為1∶120，Bax濃度為1∶240)孵育，放入4 ℃冰箱過夜，室溫復(fù)溫1 h，用PBS液漂洗3次；滴加生物素標(biāo)記IgG二抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液各30 min，PBS液漂洗3次；滴加DAB顯色劑，通過光學(xué)顯微鏡觀察顯色程度，達(dá)到最佳顯色程度后置于雙蒸水內(nèi)終止顯色反應(yīng)，用PBS液漂洗3次；蘇木素染色5 min后水洗，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸酒精分化5 s，返藍(lán)10 min；常規(guī)脫水、透明、封片；在光學(xué)顯微鏡(×400放大倍數(shù))下觀察Bcl-2及Bax在胼胝體的表達(dá)情況并采集圖片。選擇5個(gè)具有代表性的視野，運(yùn)用IPP軟件分別標(biāo)記陽性細(xì)胞(胞漿黃染為陽性細(xì)胞)及陰性細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞表達(dá)率(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)，取平均值表示Bcl-2和Bax表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析( ANOVA) ，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1髓鞘損傷及脫失情況HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠胼胝體完整，形態(tài)均勻一致；模型組胼胝體結(jié)構(gòu)不清、完整性遭破壞，可見大量空泡形成；治療組空泡較少(圖1)。LFB髓鞘染色結(jié)果顯示，對(duì)照組胼胝體完整，形態(tài)均勻一致，而模型組胼胝體可見大片區(qū)域髓鞘未被藍(lán)染，提示髓鞘脫失改變，治療組與模型組相比，髓鞘脫失率明顯減小(圖2、表1)。

2.2腦胼胝體Bcl-2和Bax表達(dá)結(jié)果見表1、圖3～4。免疫組化染色結(jié)果顯示各組大鼠腦胼胝體細(xì)胞排列均較為規(guī)則，與模型組相比，治療組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯升高，而Bax陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯降低。

注：A：模型組；B：治療組；C：對(duì)照組；箭頭所示為胼胝體結(jié)構(gòu)不清、空泡形成 圖1 各組大鼠腦胼胝體HE染色結(jié)果(比例尺=50 μm)

表1 各組大鼠髓鞘脫失率及腦組織Bcl-2和Bax陽性表達(dá)率比較(x±s，%)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞2基因，圖3同；Bax:Bcl-2相關(guān)X蛋白，圖4同

注：A：模型組；B：治療組；C：對(duì)照組 圖3 各組大鼠腦組織Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)(免疫組化，比例尺=20μm)

注：A：模型組；B：治療組；C：對(duì)照組 圖4 各組大鼠腦組織Bax陽性細(xì)胞表達(dá)水平(免疫組化，比例尺=20 μm)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病是一組以腦和脊髓髓鞘破壞或脫失為主要特征的疾病。近年來，細(xì)胞凋亡特別是少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡在脫髓鞘病變中的作用越來越受到重視。有研究結(jié)果顯示，近1/3的多發(fā)性硬化患者中，其病理改變與早期細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。Caprariello等[9]通過誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡建立了多發(fā)性硬化病理模型。目前已知多種藥物和化學(xué)制劑導(dǎo)致的中毒性脫髓鞘損害也與細(xì)胞凋亡相關(guān)[10]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡可能將在更多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中被發(fā)現(xiàn)。

在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2基因家族起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族可以大致分為兩類：一類具有抗凋亡作用，主要包括Bcl-2和Bcl-xl等；另一類則具有促凋亡作用，主要包括Bax、Bak、Bim等，目前最重要及最受關(guān)注的是Bcl-2和Bax[11]。在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中，線粒體外膜透化致使細(xì)胞色素C(CytC)釋放到細(xì)胞質(zhì)是啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟[12]。而Bcl-2與Bax蛋白能通過調(diào)控線粒體膜對(duì)CytC的通透性來影響細(xì)胞的狀態(tài)，二者的比值變化決定細(xì)胞的凋亡與生存：當(dāng)各種凋亡信號(hào)引起B(yǎng)ax高表達(dá)時(shí)，Bax蛋白形成同源二聚體，增加線粒體膜通透性，促進(jìn)線粒體中的CytC釋放至細(xì)胞質(zhì)，與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)結(jié)合形成多聚體，再進(jìn)一步與凋亡起始分子Caspase-9結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，凋亡復(fù)合體激活Caspase-9，從而激活下游的凋亡執(zhí)行分子Caspase-3等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而造成細(xì)胞凋亡；而Bcl-2高表達(dá)時(shí)，Bax蛋白與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，通過降低線粒體膜通透性，抑制CytC的釋放從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，NBP具有改善腦組織微循環(huán)及能量代謝、清除氧自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制血小板及血栓形成、抗炎等多種藥理作用，對(duì)缺血性腦卒中具有較好的治療效果[1-2]。此外，NBP還能通過多種途徑改善線粒體功能，并通過對(duì)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑進(jìn)行調(diào)控從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[3-5]。因此，針對(duì)上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中有關(guān)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，作者研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)NBP可能通過抗凋亡途徑發(fā)揮保護(hù)髓鞘的作用，并由前期研究得以初步驗(yàn)證[6]。

胼胝體為兩側(cè)大腦半球之間的聯(lián)絡(luò)纖維所構(gòu)成的腦白質(zhì)。本研究通過采用EB側(cè)腦室注射的方法誘導(dǎo)大鼠胼胝體產(chǎn)生脫髓鞘改變，進(jìn)而探討腹腔注射NBP對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦白質(zhì)髓鞘的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增多，而Bax蛋白表達(dá)明顯減少，表明NBP可能通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而對(duì)腦白質(zhì)產(chǎn)生保護(hù)作用，從而減少髓鞘的脫失。由此作者認(rèn)為，NBP可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病具有療效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)，這將為NBP的臨床應(yīng)用提供新的選擇及理論依據(jù)。關(guān)于NBP在脫髓鞘模型中作用于何種神經(jīng)細(xì)胞以及如何調(diào)控凋亡途徑仍需進(jìn)一步研究。