蘇 蘇， 孫遠(yuǎn)征， 王仕林， 李禹明

(1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 哈爾濱 150001； 2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 哈爾濱 150001)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)發(fā)病機(jī)制尚未確證，其主要癥狀表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無(wú)力、骨骼肌萎縮[1]。夾脊穴位于督脈與足太陽(yáng)經(jīng)之間，既與臟腑密切相關(guān)，又互通背部體表，于該處施針可對(duì)以上兩經(jīng)同時(shí)產(chǎn)生作用[2]。針刺可促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的傳導(dǎo)和營(yíng)養(yǎng)作用，有利于神經(jīng)元軸突的再生，促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)[3]，若給予脈沖電流刺激，可使針刺作用增強(qiáng)，臨床上已證實(shí)夾脊電針對(duì)ALS的治療作用明顯[4]。研究表明，炎癥貫穿ALS發(fā)生、發(fā)展的始終，炎癥因子可通過(guò)與神經(jīng)元表面抗體腫瘤壞死因子α受體2(TNFR2)結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)ALS疾病的進(jìn)展[5]。NF-κB是炎性反應(yīng)的經(jīng)典通路，使用anti-125b抑制NF-κB通路，可抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)ALS-SOD1G93A大鼠腰髓中p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子及促炎因子的表達(dá)，探討該信號(hào)通路在夾脊電針治療ALS中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理由hmSODlG93A陽(yáng)性C57BL/6J雄鼠與hmSODlG93A陰性C57BL/6J雌鼠繁殖得到hmSODlG93A陽(yáng)性雌性小鼠，轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠由美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。以小鼠新生記為第1天，第30天根據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室提供的引物及鑒定方案，以IL-2為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因鑒定，以表型特征對(duì)小鼠進(jìn)行表型鑒定[7]。陽(yáng)性小鼠飼養(yǎng)于黑龍江動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所，保持恒溫恒濕的SPF級(jí)環(huán)境。

共取45只ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雌性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、手針組、電針組，每組15只，另取15只同窩野生型雌性小鼠為陰性對(duì)照，第60天開(kāi)始進(jìn)行預(yù)處理實(shí)驗(yàn)：手針組給予普通針刺干預(yù)，于雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴針刺(杏林牌針灸針0.17×7mm針刺)，進(jìn)針2～3 mm，每次留針20 min，每周行針2次，共治療4周；電針組給予電針刺干預(yù)，于雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴針刺(杏林牌針灸針0.17×7 mm針刺)，進(jìn)針2～3 mm，同一組電極正負(fù)兩極連在脊柱同側(cè)，設(shè)定電流頻率2 Hz，電流強(qiáng)度不高于小鼠下肢肌肉收縮的強(qiáng)度，導(dǎo)線(xiàn)與電療儀相連，電療儀采用杭州丹頓長(zhǎng)城牌KWD-808全能脈沖電療儀。每周行針2次，共治療4周；陰性對(duì)照組、模型組于同一時(shí)間給予捆綁固定20 min，每周固定2次，共固定4周。

針刺穴位以中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸分會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》為基礎(chǔ)，同時(shí)參考中國(guó)獸牧醫(yī)學(xué)會(huì)編寫(xiě)的《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》：L1～2夾脊穴：位于督脈與膀胱經(jīng)第一側(cè)線(xiàn)間中點(diǎn)，背正中線(xiàn)旁開(kāi)約3 mm，平肋角下緣；L5～6夾脊穴：位于督脈與膀胱經(jīng)第一側(cè)線(xiàn)間中點(diǎn)，背正中線(xiàn)旁開(kāi)約3 mm，平髂嵴上緣。

1.2小鼠腰髓采集及形態(tài)學(xué)檢測(cè)第120天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取小鼠脊髓L1～6節(jié)段4℃多聚甲醛浸泡固定(透射電鏡用2.5%戊二醛固定)24 h，分別檢測(cè)如下項(xiàng)目：

1.2.1 尼氏染色 腰髓組織石蠟包埋、切片、1%焦油紫或1%硫堇染色1 h、封片并觀察。對(duì)連續(xù)切片的每第5張切片的雙側(cè)脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，每塊組織觀察10個(gè)切片。生物功能良好的神經(jīng)元識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核內(nèi)有一個(gè)清晰的大的核仁，周?chē)鸀橥暾{(lán)染色的細(xì)胞質(zhì)。

1.2.2 透射電鏡 腰髓組織依次經(jīng)切片、固定、丙酮梯度脫水、包埋、聚合、組織塊的修整、半薄切片制備、超薄切片的定位、載網(wǎng)及3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，透射電鏡下觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

1.3免疫組織化學(xué)法測(cè)定小鼠腰髓p38、p-p38的表達(dá)采用S-P法檢測(cè)腰髓p38、p-p38的表達(dá)。取腰髓組織磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，用OCT包埋劑將組織包埋并固定在載物臺(tái)上切片。將切片放入12孔板中，依次加入過(guò)氧化物酶阻斷劑、正常非特異性血清、相應(yīng)一抗、生物素標(biāo)記的二抗、鏈霉素室溫下振蕩孵育。最后經(jīng)DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡觀察，棕黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性。結(jié)果進(jìn)行評(píng)分判定。

1.4免疫熒光染色檢測(cè)小鼠腰髓p65核移位細(xì)胞爬片用預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗，加入0.5%Triton X-100室溫透化10 min，PBS漂洗，加入5%牛血清白蛋白(BSA)溶液室溫封閉1 h，PBS-T漂洗，加入p65一抗(1∶400)，37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液-吐溫20(PBST)漂洗，加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h，PBS-T漂洗，加入DAPI避光處理5 min，PBS-T漂洗三次，滴加90%甘油封片，熒光顯微鏡觀察p65染色分布情況。

1.5Westernblot小鼠脊髓L1～6段，加入細(xì)胞裂解液冰浴勻漿，裂解液于4℃下12000 r/min離心15 min提取總蛋白，上清液采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，分離的蛋白在200 mA下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，4℃下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液-吐溫20(PBST)洗滌后加入二抗室溫孵育1 h，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image pro-plus 6.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各蛋白條帶相對(duì)灰度值之比。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用Trizol法抽提各組脊髓神經(jīng)細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度法、變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度，按PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR儀7300型(美國(guó)ABI公司)，采用SYBR green法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，引物由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列祥見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的變化水平。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1各組小鼠腰髓前角尼式染色結(jié)果陰性對(duì)照組中前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目較多有(17.00±1.78)個(gè)/HP，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)異常，無(wú)空泡散在，胞質(zhì)染色均勻，核仁清晰可見(jiàn)。模型組神經(jīng)元數(shù)目為(7.48±1.46)個(gè)/HP，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性破壞，細(xì)胞核固縮，有大量散在空泡。與模型組相比，手針組[(10.93±1.84)個(gè)/HP]與電針組[15.04±1.57)個(gè)/HP]神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.05)，形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善，空泡化減少，電針組改善情況較手針組更優(yōu)，見(jiàn)圖1。

2.2各組小鼠腰髓前角神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察陰性對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞器完整而清晰，核膜完整且染色質(zhì)核內(nèi)分布均勻。模型組神經(jīng)元萎縮皺縮，線(xiàn)粒體腫脹且部分空泡化，核膜變形且部分破裂，可見(jiàn)異染色質(zhì)聚化散在，膠質(zhì)細(xì)胞在變性神經(jīng)元圍繞形成衛(wèi)星現(xiàn)象。與模型組相比，手針組與電針組細(xì)胞、線(xiàn)粒體、核膜、染色質(zhì)分布均有改善，表現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞輕度萎縮，線(xiàn)粒體腫脹及空泡化程度降低，核膜較為完整，染色質(zhì)分布較為均勻。電針組各組分形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善可見(jiàn)優(yōu)于手針組，見(jiàn)圖2。

對(duì)照組 模型組 手針組 電針組

對(duì)照組 模型組 手針組 電針組

2.3各組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1βWesternblot檢測(cè)與對(duì)照組相比，模型組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高(P<0.05)。與模型組相比，手針組與電針組TNF-α、IL-6、IL-1β含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與手針組比較，電針組TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)有所降低(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)量的比較

注： 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與手針組比較,#P<0.05。

2.4各組小鼠腰髓前角免疫組化結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，小鼠腰髓中可檢測(cè)到p38、p-p38陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于脊髓灰質(zhì)前角，中央管、白質(zhì)及其他灰質(zhì)部分表達(dá)較為微弱。與模型組相比，手針組與電針組p-p38表達(dá)減弱，以電針組減弱程度最大，見(jiàn)圖4。

圖3 TNF-α、IL-6、IL-1β在各組小鼠腰髓中的表達(dá)

p38

p-p38

2.5各組小鼠腰髓前角免疫熒光結(jié)果免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組p65(綠色熒光)主要分布于細(xì)胞質(zhì)，模型組p65主要位于細(xì)胞核，綠色熒光與藍(lán)色熒光有較大重合，表明模型組p65已從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。手針組與電針組細(xì)胞核中綠色熒光強(qiáng)度降低，而細(xì)胞質(zhì)中綠色熒光增強(qiáng)，表明手針與電針均能可抑制p65入核過(guò)程，見(jiàn)圖5。

對(duì)照組

模型組

手針組

電針組

2.6Westernblot檢測(cè)小鼠腰髓p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路蛋白與對(duì)照組比較，模型組p-IκB-α、p-p38、p-p65水平升高(P<0.05)。與模型組比較，手針組與電針組p-IκB-α、p-p38、p-p65蛋白水平下降(P<0.05)。與手針組相比，電針組p-IκB-α、p-p38、p-p65表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組總p38、p65、IκB-α蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖6。

2.7各組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，模型組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)提高(P<0.05)。與模型組相比，手針組與電針組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與手針組比較，電針組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表4。

表3 各組小鼠腰髓p38、p65、IκB-α及各磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)比較

注： 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與手針組比較,#P<0.05。

圖6 p38、p65、IκB-α及各磷酸化蛋白在小鼠腰髓中的表達(dá)

表4 各組小鼠腰髓TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)比較

注： 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與手針組比較,#P<0.05。

3 討論

在ALS早期，小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓和外周神經(jīng)中聚集并活化，介導(dǎo)慢性炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)一步影響脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能[8]。研究表明活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大量p38 MAPK和NF-κB被激活，促進(jìn)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，向外周釋放大量誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6、白介素-8(IL-8)、TNF-α、IL-1β等促炎因子。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，模型組腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量減少，大量小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞于變性神經(jīng)細(xì)胞周?chē)?，尼氏體染色不清晰，核固縮，線(xiàn)粒體空泡化嚴(yán)重，表現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)元炎癥變性。經(jīng)手針、電針處理后，癥狀明顯改善，相比手針，電針改善程度更高一些。模型組的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯上升，電針組以上3種因子的含量明顯低于模型組與手針組，提示電針組能顯著抑制腰髓前角炎癥反應(yīng)的發(fā)生，抑制了由于炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡壞死，從而改善腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活性與功能，起治療ALS的作用。研究表明IL-6參與ALS小鼠的NK-κB信號(hào)通路傳導(dǎo)，并與NK-κB起到相互刺激和激活的作用[9-10]，與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

本研究進(jìn)一步觀察電針刺激對(duì)MAPK-NF-KB的關(guān)鍵蛋白p38及其磷酸化的作用、IκB-α、p65的磷酸化及入核的影響。結(jié)果顯示，在脊髓前角部位，電針組神經(jīng)元內(nèi)p38的磷酸化明顯降低， IκB-α、p65磷酸化明顯降低，免疫熒光結(jié)果顯示電針組能抑制p65的入核過(guò)程，與Hu等[9]研究結(jié)果一致。在NK-κB經(jīng)典激活通路中，p50/p65與抑制因子IκB-α結(jié)合形成三聚體，此時(shí)NF-κB為無(wú)活性狀態(tài)[11]，當(dāng)有外界刺激作用于細(xì)胞時(shí)，IKK的IKKp亞基被磷酸化激活，引起IκBαSer32和Ser36位點(diǎn)被磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解，NF-κB得以釋放并進(jìn)行核易位[9]，之后特異性地結(jié)合于κB位點(diǎn)啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。因此本次研究說(shuō)明，電針刺激可抑制對(duì)IκB-α的磷酸化，加強(qiáng)對(duì)NK-κB抑制作用，p65難以在胞質(zhì)中被釋放且被磷酸化，抑制p65進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。對(duì)下游基因mRNA的檢測(cè)，也證實(shí)電針能降低TNF-α、IL-6、IL-1β轉(zhuǎn)錄水平。譚晶[10]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，p38 siRNA顯著抑制p38基因的表達(dá)，降低p65的磷酸化水平，在降低IKKβ的磷酸化的同時(shí)，還增加了IκB-α在細(xì)胞質(zhì)的穩(wěn)定性，說(shuō)明對(duì)p38的抑制可進(jìn)一步介導(dǎo)對(duì)NK-κB通路的抑制作用。

綜上所述，夾脊電針能通過(guò)抑制p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，降低TNF-α、IL-6、IL-1β轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷作用，緩解ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的病情，為夾脊電針治療ALS的臨床推廣提供了詳實(shí)的理論依據(jù)。