周 凱， 王 磊， 海力茜·陶爾大洪

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

關(guān)健詞： 庫爾勒香梨； 多糖； 提??； 響應(yīng)面

庫爾勒香梨(PyrussinkiangensisYu)為薔薇科梨屬新疆梨種的果實(shí)，是瀚海梨與鴨梨的雜交品種，種植歷史達(dá)1 400余年[1]。庫爾勒香梨是新疆特有品種，因產(chǎn)自庫爾勒地區(qū)而得名[2-3]，庫爾勒香梨尤以其獨(dú)特的氣味和口感享譽(yù)國內(nèi)外[4]。研究表明庫爾勒香梨主要化學(xué)成分為多糖、甾體、黃酮、三萜和揮發(fā)油等，其中多糖含量相對較高[5-6]。植物多糖具有提高機(jī)體免疫力，毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)庫爾勒香梨多糖具有調(diào)節(jié)免疫和鎮(zhèn)咳化痰作用[8-9]。本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對庫爾勒香梨多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為更好地開發(fā)庫爾勒香梨資源提供研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器752N型紫外分光光度儀(上海精科儀器廠)，ML-204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)，N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械工廠)。

1.2試藥無水乙醇(山東佰仟化工有限公司，批號10009218)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號20150520)，苯酚(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號20160711)，葡萄糖(成都維克奇生物科技有限公司，批號 H5102634)，苯(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號 2015312)，濃硫酸(河南升宏化工產(chǎn)品有限公司，批號20161212)。

1.3藥材庫爾勒香梨2017年8月購于庫爾勒沙依東園藝場，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥/天藥教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為庫爾勒香梨(PyrussinkiangensisYu)的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1庫爾勒香梨多糖供試液的制備庫爾勒香梨洗凈去核切片，于通風(fēng)陰涼處晾干，稱取5.00 g于圓底燒瓶，按質(zhì)量體積比為1∶60(g∶mL)加入蒸餾水，90℃浸漬提取2次，每次180 min，合并2次提取液，旋蒸濃縮，濃縮液用無水乙醇調(diào)整至乙醇濃度為80%，于4℃冰箱放置12 h后待沉淀析出，棄上清液，沉淀置于蒸發(fā)皿中90℃水浴加熱濃縮至膏狀，晾干即得庫爾勒香梨多糖。稱取庫爾勒香梨多糖40.00 mg，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得0.40 mg/mL 的庫爾勒香梨多糖供試液，備用。

2.2回歸方程的建立稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品40.00 mg于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.40 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于50 mL容量瓶中，取等量蒸餾水作空白對照，冰水浴5 min，分別加入0.2 %蒽酮-硫酸試液(稱取0.2 g蒽酮加100 mL濃硫酸)4.0 mL，用蒸餾水定容至刻度，100℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，靜置10 min，在490 nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=12.079X+0.092 5,r=0.999 7，在0.010 5～0.065 2 mg/mL濃度范圍內(nèi)回歸方程線性關(guān)系良好。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液6 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下方法測定吸光度，平行測定6次，吸光度值分別為：0.677、0.678、0.679、0.679、0.676、0.678，RSD=0.2%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下庫爾勒香梨供試液6.0 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下方法操作測定吸光度，平行測定6次，吸光度值分別為：0.235、0.230、0.232、0.232、0.239、0.234，RSD=1.4%(n=6)，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下庫爾勒香梨供試液6.0 mL置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測定分別放置5、10、15、20、25和30 min時(shí)的吸光度，吸光度值分別為：0.247、0.238、0.245、0.239、0.245、0.243，RSD=1.5%(n=6)，表明30 min內(nèi)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取9份“2.1”項(xiàng)下庫爾勒香梨供試液1.0 mL 置于50 mL容量瓶中，分別加入“2.2”項(xiàng)下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0 mL各3份，蒸餾水定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下方法測吸光度，計(jì)算平均加樣回收率為101.8%，RSD=1.8%。

2.4單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 提取溫度對庫爾勒香梨多糖提取率的影響 按“2.1”項(xiàng)下操作在提取時(shí)間為120 min，料液比為1∶60(g∶mL)，提取次數(shù)為2次的條件下，設(shè)定提取溫度分別為：60、70、80、90℃，提取庫爾勒香梨多糖。隨著提取溫度的升高，庫爾勒香梨多糖提取率先增大后減小，當(dāng)提取溫度為70℃ 時(shí)，多糖提取率最高，見表1。

表1 不同提取溫度對庫爾勒香梨多糖提取率的影響

2.4.2 提取時(shí)間對多糖提取的影響 按“2.1”項(xiàng)下操作，固定提取溫度為70℃，料液比為1∶60(g∶mL)，提取次數(shù)為2次的條件下，設(shè)定提取時(shí)間分別為：90、120、150、180 min，提取庫爾勒香梨多糖，當(dāng)提取時(shí)間為180 min時(shí)，多糖提取率最高，見表2。

表2 不同提取時(shí)間對庫爾勒香梨多糖提取率的影響

2.4.3 料液比對多糖提取率的影響 按“2.1”項(xiàng)下操作，固定提取溫度70 ℃，提取時(shí)間120 min，提取次數(shù)為2次，設(shè)定料液比依次為1∶40，1∶50，1∶60，1∶70(g∶mL)，提取庫爾勒香梨多糖，當(dāng)料液比為1∶60(g∶mL)時(shí)，多糖提取率最高，見表3。

表3 不同料液比對庫爾勒香梨多糖提取率的影響

2.4.4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響 按“2.1”項(xiàng)下操作,固定提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為120 min，料液比1∶60(g∶mL)，改變提取次數(shù)，設(shè)定提取次數(shù)分別為1、2、3次，提取庫爾勒香梨多糖，提取次數(shù)為3次時(shí)，提取率最高，見表4。

表4 不同提取次數(shù)對庫爾勒香梨多糖提取率的影響

2.5Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 從單因素實(shí)驗(yàn)的考察結(jié)果中選取提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)3個(gè)對庫爾勒香梨多糖提取率顯著影響的因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，響應(yīng)面的影響因素水平表及17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，見表5、6。

表5 響應(yīng)面的影響因素水平表

2.5.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 以庫爾勒香梨多糖提取率為響應(yīng)面值Y，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到如下擬合全變量二次回歸方程：Y=12.42+0.065A+0.37B-0.28C-0.065AB-5 000AC-0.24BC-1.09A2-1.24B2-2.83C2。由F值大小判斷，各因素對庫爾勒香梨多糖提取率的影響大小順序?yàn)椋築>C>A，見表7。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表7 響應(yīng)面二次模型方差分析表

2.5.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 由各因素交互作用影響的響應(yīng)面圖顯示，位于中心的點(diǎn)為庫爾勒香梨提取率最高點(diǎn)。優(yōu)化的最佳提取條件為在回歸方程中A2、B2、C2對庫爾勒香梨多糖提取率影響極顯著，AB、BC和AC對多糖提取率影響不顯著。根據(jù)模型優(yōu)化的最佳提取條件為：提取溫度70℃、料液比1∶60、提取時(shí)間95 min，此時(shí)提取率為12.46%,見圖1～3。

圖1 A(溫度)、C(料液比)交互作用影響的響應(yīng)面圖

圖2 B(時(shí)間)、C(料液比)交互作用影響的響應(yīng)面圖

圖3 A(溫度)、B(時(shí)間)交互作用影響的響應(yīng)面圖

2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取響應(yīng)面法得出的庫爾勒香梨多糖提取工藝的最優(yōu)條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證最優(yōu)工藝的準(zhǔn)確性，實(shí)測值與預(yù)測值相對誤差基本一致，說明理論提取工藝有效可行，見表8。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 討論

本研究對庫爾勒香梨多糖提取方法進(jìn)行了單因素考察和響應(yīng)面優(yōu)化，經(jīng)過最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到了庫爾勒香梨提取工藝最佳條件：提取時(shí)間95 min、料液比1∶60、提取溫度70℃。采用此方法提取庫爾勒香梨多糖的提取率為12.46%，提取率較高，且提取方法和提取結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以為后續(xù)對庫爾勒香梨多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究提供研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。針對庫爾勒香梨多糖的提取方法還有超高壓法、超聲波提取法等[10-11]，與本實(shí)驗(yàn)提取方法相比較，其提取率更高，但由于條件劇烈，不排除其方法會(huì)對多糖的結(jié)構(gòu)造成一定破壞，具體還需進(jìn)行深入的研究。近年來，一些新的提取方法也越來越多的運(yùn)用到了植物多糖的提取過程中，例如，冷凍提取法、閃式提取法、總黃酮和總多糖聯(lián)合提取法和復(fù)合酶提取法，這些提取方法操作更加簡便，但提取率相對較低[12-16]。本研究提取方法條件溫和，提取試劑僅有水和乙醇，可最大程度保證多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定并減少雜質(zhì)的引入，適用于庫爾勒香梨多糖的提取。