張方靜，羅 峰，譚殷殷，張旻桓，邢 文，金曉玲,2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

月季(RosachinensisJacq)為薔薇科薔薇屬植物，半常綠低矮灌木，四季開花，故又稱長(zhǎng)春花、斗雪紅、四季花等，是我國(guó)傳統(tǒng)十大名花之一，在園林和花卉市場(chǎng)上占有非常重要的地位。月季生長(zhǎng)最適溫度為15～26 ℃，30 ℃以上的高溫會(huì)導(dǎo)致月季花芽停止分化，無(wú)法正常開花，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致白粉病、黑斑病等病害產(chǎn)生，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值。因此，了解月季耐熱性機(jī)制成為研究重點(diǎn)。目前,關(guān)于月季耐熱性研究主要集中在生理方面,游離脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉綠素(Chl)含量、丙二醛(MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率(Rec)、可溶性蛋白(SP)含量均與月季耐熱性有關(guān)[1-2]。近年來(lái)，眾多研究表明,葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)能夠反映高溫對(duì)植物的傷害，是篩選植物耐高溫品種的重要技術(shù)手段，被廣泛應(yīng)用于植物耐熱性研究[3-5]。關(guān)于葉綠素?zé)晒庠谠录究鼓嫘匝芯恐械膽?yīng)用，主要體現(xiàn)在利用葉綠素?zé)晒鈦?lái)評(píng)價(jià)月季的耐弱光性，以及土壤水分脅迫下月季的光合特性等[6-7]。月月紅和月月粉是最初被引種至歐洲參與品種培育的中國(guó)種源之一，大部分鮮切花都是由這2種月季作為父母本雜交而來(lái)[8]，對(duì)于月季的育種有著重要的意義。關(guān)于這2種月季對(duì)高溫的生理響應(yīng)和葉綠素?zé)晒馓匦陨形匆?jiàn)報(bào)道。鑒于此，以月月紅和月月粉為試材，研究高溫脅迫對(duì)2種月季生理指標(biāo)和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，并結(jié)合主成分分析及隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)其耐熱性，為研究月季耐熱性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為月月紅和月月粉的2年生扦插苗。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018年3月在中南林業(yè)科技大學(xué)園林植物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的月月紅、月月粉盆栽苗，培養(yǎng)基質(zhì)配方為V(泥炭土)∶V(椰糠)∶V(蛭石)=3∶1∶1，高溫處理前把植株放入人工氣候箱(25 ℃)中培養(yǎng)7 d，隨后進(jìn)行高溫處理，溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃，連續(xù)高溫誘導(dǎo)8 h，利用電導(dǎo)率儀測(cè)定2種月季在不同處理溫度下的電導(dǎo)率，根據(jù)Logistic方程，計(jì)算半致死溫度(LT50)。

根據(jù)LT50設(shè)置脅迫溫度為45 ℃，脅迫時(shí)間為0、2、6、12、24 h，以0 h為對(duì)照。處理過(guò)程中空氣相對(duì)濕度為80%，光照強(qiáng)度為5 000 lx。處理時(shí)間過(guò)后，立即取高溫處理不同時(shí)間段的葉片，測(cè)量Rec、Chl含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)，剩余葉片用液氮速凍后放入超低溫冰箱(-80 ℃)保存，以備測(cè)定其余生理指標(biāo)。每棵植株上選取3片葉進(jìn)行測(cè)量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

Rec采用電導(dǎo)儀測(cè)定法，Chl含量采用丙酮、乙醇混合液提取法，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法，SS含量采用蒽酮比色法，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法，Pro含量采用茚三酮顯色法，SOD活性采用NBT法[9]。

采用LI-6400型便攜式光合儀(Li-Cor,Lincoln,美國(guó))測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)[10]：光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)、光合電子傳遞速率(ETR)、有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv′/Fm′)、固定熒光(Fo)。所有指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

(1)運(yùn)用隸屬函數(shù)法計(jì)算2種月季的隸屬函數(shù)值，通過(guò)隸屬函數(shù)值來(lái)評(píng)價(jià)2種月季的耐熱性[11]。公式如下:若耐熱指標(biāo)與耐熱性正相關(guān)，其公式為：

U(xi)=(xi-ximin)/(ximax-ximin)，i=1,2,3,…,n

若耐熱指標(biāo)與耐熱性負(fù)相關(guān)，其公式為：

U(xi) = 1-(xi-ximin) /(ximax-ximin)

式中，U為隸屬函數(shù)值；xi為某項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值；ximin、ximax為所有參試材料中該項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

(2)耐熱性主成分分析權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法[12]如下：

Wi=pi/∑pi,i=1,2,3,…,n

其中，i表示各指標(biāo)，pi為各種指標(biāo)在第i各主成分的貢獻(xiàn)率，F(xiàn)ij表示該指標(biāo)在第j主成分上的負(fù)荷量，Yij表示第j主成分的貢獻(xiàn)率，Wi表示第i各主成分在所有主成分中的重要程度。

(3)耐熱性綜合指數(shù)計(jì)算方法[11]如下：

D=∑[U(xi)×Wi],i=1,2,3,…,n

其中，D代表供試材料耐熱性綜合指數(shù)，D越大表示其耐熱性越強(qiáng)，反之則越弱。

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析、主成分分析，采用Origin 9.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)2種月季生理指標(biāo)的影響

2.1.1 2種月季LT50的確定 根據(jù)相對(duì)電導(dǎo)率擬合的Logistic方程可得出2種月季的LT50(表1)。由表1可知,月月紅和月月粉的擬合度(R2)分別為0.94、0.79，均達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。月月紅、月月粉的LT50分別為49.33、50.04 ℃。

表1 不同高溫處理下月月紅和月月粉的LT50

注：*、**表示顯著、極顯著。

Note:*,** indicate significant,extremely significant difference.

2.1.2 細(xì)胞膜透性 由圖1A可知，2種月季的Rec隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高。2種月季不同脅迫時(shí)間的Rec均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2 h，月月紅與CK無(wú)顯著差異，月月粉與CK差異顯著；高溫脅迫6～12 h，2種月季均與CK差異顯著，月月紅Rec顯著上升，月月粉無(wú)顯著變化；高溫脅迫12～24 h，月月紅和月月粉的Rec均顯著上升。

由圖1B可知，2種月季的MDA含量隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的MDA含量均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2～12 h，2種月季MDA含量均顯著高于CK；高溫脅迫24 h，月月紅與CK無(wú)顯著差異，月月粉與CK差異顯著。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著,下同

2.1.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 如圖2A所示，2種月季的SP含量隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的SP含量均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2 h，2種月季的SP含量均與CK無(wú)顯著差異；高溫脅迫6 h，2種月季SP含量均與CK差異顯著，且達(dá)到最大值；高溫脅迫12 h，2種月季SP含量均下降；高溫脅迫24 h，月月紅與CK無(wú)差異顯著，而月月粉與CK差異顯著。

如圖2B所示，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，月月紅Pro含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，月月粉則呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的Pro含量均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2～6 h，月月紅Pro含量均與CK差異顯著，月月粉均與CK差異不顯著，且月月紅Pro含量顯著上升；高溫脅迫12 h,2種月季的Pro含量均與CK差異顯著；高溫脅迫24 h，月月紅與CK差異不顯著，月月粉與CK差異顯著。

由圖2C可知，2種月季SS含量隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的SS含量均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2 h,2種月季的SS含量與CK相比均無(wú)顯著差異；高溫脅迫6 h，2種月季SS含量均與CK差異顯著，且月月紅SS含量達(dá)到峰值；高溫脅迫12 h，月月紅SS含量與CK無(wú)顯著差異，而月月粉SS含量與CK差異顯著且達(dá)到峰值；高溫脅迫24 h，月月紅與CK無(wú)顯著差異，而月月粉與CK差異顯著。

圖2 高溫脅迫下月月紅和月月粉SP、Pro、SS含量的變化Fig.2 The change of soluble protein, proline and soluble sugar content of Slater and Old Blush under high temperature stress

2.1.4 SOD活性 如圖3所示，2種月季SOD活性隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的SOD活性均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2 h，月月紅與CK無(wú)顯著差異，而月月粉則差異顯著；高溫脅迫6 h，2種月季均與CK差異顯著，且月月紅的SOD活性達(dá)到峰值；高溫脅迫12 h，2種月季均與CK差異顯著，且月月粉的SOD活性達(dá)到峰值；高溫脅迫24 h，2種月季SOD活性均與CK差異顯著。

圖3 高溫脅迫下月月紅和月月粉SOD活性的變化Fig.3 The change of SOD activity of Slater and Old Blush under high temperature stress

2.1.5 Chl含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù) 如圖4A所示，隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，月月紅的Chl含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，月月粉的Chl含量呈下降趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的Chl含量均差異顯著(P<0.05)。高溫脅迫2 h,2種月季的Chl含量均與CK無(wú)顯著差異；高溫脅迫6～12 h，2種月季均與CK差異顯著；高溫脅迫24 h，月月紅與CK無(wú)顯著差異，而月月粉則差異顯著。

如圖4B—4G所示，隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，2種月季的Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，qN、Fo呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)。2種月季不同脅迫時(shí)間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)均具有顯著差異(P<0.05)。高溫脅迫2 h，除月月紅Fo外，2種月季其余各指標(biāo)均與CK差異顯著；高溫脅迫6 h,2種月季的所有葉綠素?zé)晒鈪?shù)均與CK差異顯著，其中，F(xiàn)m、qP、ETR、Fv′/Fm′顯著低于CK，而qN、Fo顯著高于CK；高溫脅迫12～24 h，月月紅Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均顯著下降，而月月粉除Fm、Fv′/Fm′顯著下降外，qP、ETR無(wú)顯著變化，月月紅的qN與Fo均顯著上升，月月粉則表現(xiàn)為Fo顯著上升，而qN無(wú)顯著變化。

2.2 2種月季耐熱指標(biāo)的篩選

對(duì)月月紅和月月粉13項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，通過(guò)各指標(biāo)的貢獻(xiàn)率可得知各指標(biāo)的重要性。由表2可知，月月紅、月月粉3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了93.579%、95.841%。月月紅第1主成分貢獻(xiàn)率為56.410%，包括Rec、qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo等7項(xiàng)指標(biāo)，反映了高溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜透性和光合作用的影響，月月粉第1主成分貢獻(xiàn)率為74.114%，包括Chl含量、SS含量、Rec、Pro含量、MDA含量、qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo等指標(biāo)，主要反映高溫對(duì)膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和光合作用的影響；月月紅第2主成分貢獻(xiàn)率為25.992%，包括SS含量、SP含量、SOD活性、MDA含量等4項(xiàng)指標(biāo)，主要說(shuō)明了高溫脅迫對(duì)膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶活性的影響，月月粉第2主成分貢獻(xiàn)率為13.906%，指標(biāo)為SOD活性，反映了高溫脅迫對(duì)保護(hù)酶的影響；月月紅第3主成分貢獻(xiàn)率為11.178%，包括Pro含量、Chl含量，主要反映了葉綠素情況，月月粉第3主成分貢獻(xiàn)率為7.821%，主要指標(biāo)為SP含量，反映了高溫對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。

圖4 高溫脅迫下月月紅和月月粉Chl含量、Fm、qP、ETR、qN、Fv′/Fm′、Fo的變化Fig.4 The change of Chl content,Fm,qP,ETR,qN,Fv′/Fm′,Fo of Slater and Old Blush under high temperature stress

綜上所述，月月紅生理指標(biāo)Rec、SS含量、SOD活性、MDA含量和熒光參數(shù)qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo載荷量較大，可作為月月紅耐熱性的鑒定指標(biāo)；月月粉生理指標(biāo)Chl含量、SS含量、Rec、SOD活性和熒光參數(shù)qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo載荷量較大，可作為月月粉耐熱性的鑒定指標(biāo)。

表2 月月紅和月月粉耐熱指標(biāo)主成分分析

2.3 2種月季耐熱性綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)2種月季的Chl含量、SS含量、SP含量、SOD活性等13項(xiàng)指標(biāo)的耐熱性隸屬函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)主成分分析結(jié)果對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行合成，獲得2種月季的耐熱性綜合指數(shù)(D)(表3)。月月紅的綜合指數(shù)為0.520，月月粉的綜合指數(shù)為0.496，說(shuō)明月月紅的耐熱性稍強(qiáng)于月月粉。

表3 月月紅和月月粉耐熱指標(biāo)隸屬函數(shù)值Tab.3 Heat resistance index membership function value of Slater and Old Blush

3 結(jié)論與討論

眾多研究表明，高溫脅迫下，植物的生理代謝及光合作用會(huì)發(fā)生不同程度的變化，主要表現(xiàn)為葉綠素降解，細(xì)胞膜透性增大，活性氧含量增加，啟動(dòng)抗氧化酶和非酶抗氧化物質(zhì)發(fā)生應(yīng)答性變化[13]，以及光合作用過(guò)程中光能的吸收和轉(zhuǎn)化、能量轉(zhuǎn)運(yùn)和PSⅡ的活性等,在植物光合作用與環(huán)境關(guān)系的研究中起著重要作用[14]。前人研究認(rèn)為，本試驗(yàn)中所有生理指標(biāo)均能作為月季耐熱性鑒定指標(biāo)，而本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)13個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分篩選，認(rèn)為生理指標(biāo)Rec、SOD活性、SS含量、MDA含量、Chl含量和熒光參數(shù)qP、qN、Fm、ETR、Fv′/Fm′、Fo與月季的耐熱性密切相關(guān)。

高溫會(huì)導(dǎo)致膜內(nèi)脂的變化，使其細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)會(huì)有不同程度的外滲，傷害越大，外滲越大，電導(dǎo)率增加越大[15]。在高溫脅迫下隨著脅迫時(shí)間增加，2種月季Rec均顯著增大，與楊華庚等[16]研究蝴蝶蘭的結(jié)果一致。MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物之一，隨著膜傷害的發(fā)生，使其體內(nèi)可溶性物質(zhì)大量滲漏[17]。本研究表明，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種月季MDA含量呈先升后降趨勢(shì)，在處理6 h均達(dá)到峰值，隨后下降，可能是由于脅迫強(qiáng)度太大導(dǎo)致不能正常合成MDA，月月紅脅迫24 h與CK無(wú)顯著差異，而月月粉差異顯著，說(shuō)明高溫對(duì)月月粉傷害更顯著。

SP和Pro都是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物遭受高溫會(huì)主動(dòng)積累SP、Pro，以此來(lái)抵御高溫帶來(lái)的傷害[18-19]。本試驗(yàn)中，2種月季SP、Pro含量隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)均有不同程度的增加，說(shuō)明Pro、SP在月季抗高溫機(jī)制中有較大作用。且月月紅SP含量明顯高于月月粉，說(shuō)明月月紅抵御高溫能力強(qiáng)于月月粉。2種月季SS含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，月月紅在脅迫6 h達(dá)到峰值，隨后下降，月月粉在12 h達(dá)到峰值后下降，這與葉小梅等[20]研究的高溫脅迫下月季SS含量變化趨勢(shì)一致，脅迫前期通過(guò)積累SS抵御高溫，脅迫后期可能是由于高溫下植物呼吸作用大于光合作用，消耗體內(nèi)SS，從而造成SS含量下降。但在脅迫24 h后，月月紅與CK無(wú)顯著差異，月月粉差異顯著，說(shuō)明高溫對(duì)月月粉傷害更大。

有研究表明，SOD活性與植物耐熱性息息相關(guān)，并隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)[21-22]，這與本試驗(yàn)中所顯示趨勢(shì)一致，出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是脅迫前期，植物自身能夠提高SOD活性來(lái)抵御高溫傷害，后期脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而超過(guò)植物本身的承受能力，使得酶活性下降[15]。本試驗(yàn)中，月月紅處理6 h達(dá)到峰值，且SOD活性明顯高于月月粉，說(shuō)明此期間月月紅抵御高溫能力更強(qiáng)，而月月粉則在處理12 h后達(dá)到峰值，說(shuō)明月月紅對(duì)高溫響應(yīng)主要在脅迫前期，月月粉在后期。

PSⅡ?qū)δ婢趁{迫非常敏感，高溫會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化[23]。研究表明，qP、qN、ETR、Fm、Fv′/Fm′、Fo均與植物耐熱性有關(guān)[24-25]。本試驗(yàn)中，45 ℃的高溫能夠誘導(dǎo)2種月季的Fo、qN上升，鐘敏等[14]認(rèn)為，F(xiàn)o上升可能是高溫使PSⅡ反應(yīng)中心產(chǎn)生破壞，從而導(dǎo)致電子傳遞受阻，qN上升說(shuō)明高溫使葉片光能熱耗散增加，有利于耗散過(guò)剩光能，從而適應(yīng)高溫。高溫下2種月季的Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且均在處理24 h達(dá)到最低值，表明高溫使PSⅡ反應(yīng)中心光化學(xué)轉(zhuǎn)換效率下降。就2種月季而言，月月紅脅迫2 h后Fm、qP、ETR、Fv′/Fm′下降幅度最大，而月月粉在脅迫6～12 h下降波動(dòng)最大，說(shuō)明脅迫前期月月紅對(duì)高溫的響應(yīng)明顯，而月月粉響應(yīng)高溫主要在后期，前人研究中也有類似結(jié)果[26]。此外，Chl含量與植物光合效率密切相關(guān)，植物葉片的受損情況能夠反映高溫對(duì)植物的傷害程度。高溫會(huì)導(dǎo)致月季Chl含量下降[26]。本試驗(yàn)中，月月紅Chl含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，月月粉Chl含量呈下降趨勢(shì)，后期上升可能是由于脅迫時(shí)間短，沒(méi)有達(dá)到抑制光合作用的程度，葉綠素不穩(wěn)定[27]。脅迫至24 h，月月紅Chl含量與CK差異不顯著，而月月粉差異顯著，說(shuō)明高溫對(duì)月月粉傷害更明顯。

本研究從生理特性及葉綠素?zé)晒夥矫娉醪教接懥?種月季的耐熱機(jī)制和應(yīng)激反應(yīng)，篩選出與月季耐熱性相關(guān)的指標(biāo)，并進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)。高溫對(duì)植物的影響是多方面的，可以利用生理特性和葉綠素?zé)晒鈦?lái)分析植物受逆境傷害程度。后期可考慮從熱激蛋白或熱激轉(zhuǎn)錄因子等方面深入分析其耐熱機(jī)制。