張喜悅

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

1 醫(yī)用結(jié)核病疫苗研究現(xiàn)狀

全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是導致人類死亡的十大原因之一，每年有數(shù)百萬人患上結(jié)核病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，2017年全球約有1 000萬人新感染結(jié)核，我國估計有88.9萬人新感染結(jié)核[1]。然而，在過去的100年里，唯一實際應用的疫苗仍然是卡介苗（Bacille calmette guerin，BCG）。近年來，隨著基因技術的進步，學者們嘗試從多種途徑研發(fā)新型疫苗。常用的研發(fā)途徑有3種：一是對卡介苗進行改進，包括重組卡介苗，或者對野毒株進行改進，開發(fā)出新的疫苗；二是使用病毒載體或結(jié)核免疫原性蛋白質(zhì)，加上必要的佐劑；三是開發(fā)治療性疫苗，以減少結(jié)核病治療的持續(xù)時間。目前，進入臨床試驗的新型疫苗共有15種[1]，另外還有2種臨床試驗終止疫苗（表1）。

2 牛結(jié)核病疫苗研究現(xiàn)狀

2.1 野生動物疫苗

世界很多發(fā)達國家均較好地實施了牛結(jié)核病根除計劃。這些根除計劃是基于檢疫撲殺策略實施的。但該策略存在著很多問題，如野生動物宿主的存在嚴重影響牛結(jié)核病防控。英國和愛爾蘭的獾、新西蘭的刷尾負鼠、西班牙的野豬等均為牛結(jié)核病易感動物宿主，且這些宿主持續(xù)向家畜傳播牛結(jié)核病，使得這些地區(qū)牛結(jié)核病的根除變得極為困難。因此，必須考慮對這些野生動物應用疫苗，以控制牛結(jié)核病。

用BCG免疫野生動物，會導致野生動物向家畜傳播BCG并存在干擾結(jié)核菌素試驗（PPD）的可能性，但這種情況尚未被證實。BCG可在某些種類的野生動物（白尾鹿）體內(nèi)，存活達9個月，并可傳播至其同群動物。因此，在野生動物免疫BCG的情況下，應該考慮在該地區(qū)的牛中，也使用疫苗進行免疫，以防止疫苗株由野生動物向牛傳播。目前，新西蘭、英國和西班牙等地均已開展了野生動物免疫試驗[5-6]。

新西蘭刷尾負鼠：1995—2002年，攻毒試驗證實口服、注射和黏膜（如噴氣裝置）免疫有顯著效果；2009年，田間試驗證實BCG免疫有69%～95%的效果?？诜囼炛校瑢CG包裹于脂質(zhì)體中，可防止胃液失活疫苗活性。同時在誘餌上使用防水措施，并將誘餌掛于刷尾負鼠棲息地的樹上，這樣可有效提高免疫率。

英國獾：1998年至今，攻毒試驗證實口服、注射和黏膜（如噴氣裝置）免疫有顯著效果。2011年，田間試驗證實BCG免疫可使血清學陽性率降低73.8%[5]。

表1 臨床和臨床終止階段的結(jié)核病新型疫苗研究狀況[2-4]

西班牙野豬：2009年至今，試驗證實BCG可提供有效保護。2011年至今，證實滅活的牛分枝桿菌可提供類似于BCG的保護作用。

2.2 牛疫苗

由于牛結(jié)核病疫苗會對PPD形成干擾，造成假陽性，現(xiàn)在全球都禁止使用疫苗免疫牛。WHO也不贊同使用疫苗免疫牛，但很多學者仍然進行了大量的牛結(jié)核病疫苗研究。

在過去的20年中，牛結(jié)核病疫苗研究取得了一些重要進展，主要集中在減毒分枝桿菌菌株、DNA疫苗、亞單位疫苗（如培養(yǎng)濾液蛋白、MPB70）研發(fā)和免疫策略研究上。對于DNA和亞單位疫苗中不同免疫調(diào)節(jié)劑（如脂肽、CpG、菌落刺激因子等）的應用，也進行了廣泛研究。某些DNA、亞單位疫苗可明顯增強BCG的免疫效果，但單獨使用時其效果均弱于BCG。因此，當前可以進行田間應用的免疫策略是單獨使用BCG，或者使用BCG初免、新型疫苗加強免疫的免疫策略。試驗已經(jīng)證實，腺病毒載體Ag85A疫苗，在攻毒試驗中可以保護大部分牛免于形成結(jié)核病變[7-9]。

由于檢疫撲殺策略未能防止牛結(jié)核病流行，英國開展了大量的牛結(jié)核病疫苗研發(fā)工作，如開展了免疫保護試驗[8]，以驗證疫苗對牛的保護力。從2005年開始，APHA即開始進行試驗。試驗對象為80頭免疫牛、64頭對照牛。攻毒試驗中，80頭免疫牛中的29頭牛沒有病變，而64頭對照牛中，僅有2頭牛沒有病變。免疫牛中的無病變牛，細菌培養(yǎng)也呈陰性，表明BCG甚至在重度攻毒試驗中，仍能提供有效保護。免疫后25 d可建立免疫反應，基于可見病變減少的程度，表明疫苗的保護率為76%（50%～100%）。同其他動物一樣，BCG對?？梢蕴峁┎煌潭鹊谋Ｗo，對部分牛只不產(chǎn)生保護。當BCG接種于新生牛和犢牛時，其產(chǎn)生的保護作用要高于接種于成年牛；BCG Pasteur株和BCG Danish 株可以誘導相等的保護力，黏膜免疫也會產(chǎn)生保護力。BCG免疫會干擾PPD，且這種干擾至少會持續(xù)6個月。BCG的保護力與PPD陽性情況并不相關，如皮膚試驗陰性的BCG免疫動物，仍然會像皮膚試驗陽性的BCG免疫動物一樣被保護。同時，還有試驗認為，BCG免疫后，其保護力可維持12個月，免疫24個月后保護力明顯下降。

增強BCG免疫效果的方法有兩個：一是初免時擴大或加強免疫，二是在免疫效應降低時加強免疫。新西蘭研究者認為，小牛在6周后用BCG加強免疫，反而會影響初免時BCG的保護力。目前最成功的免疫策略是利用Ag85A病毒載體疫苗加強免疫。APHA在過去6年的試驗中發(fā)現(xiàn)，BCG-病毒載體疫苗的免疫策略始終表現(xiàn)出強化BCG效果的效應，如比BCG免疫更少的可見病變動物和病理變化，且這種效應與人醫(yī)疫苗的研究成果一致。因此，針對牛結(jié)核病，最有效的免疫策略是BCG初免，新型疫苗加強免疫。

但牛結(jié)核病疫苗的應用，面臨著科學和法律法規(guī)的挑戰(zhàn)：一是必須要有適當?shù)蔫b別診斷試劑，因為BCG會干擾正常的PPD；二是歐盟國家禁止免疫牛，必須要改變這些法律法規(guī)；三是疫苗需要更多的安全性試驗，以說服決策者接受使用疫苗的建議。為此，歐盟開展了結(jié)核病階梯項目（TBSTEP）[10]。該項目的主要目標是研究根除牛結(jié)核病的適當策略。項目組由多領域的成員組成，包括研發(fā)疫苗和診斷試劑的小組，其目標為：（1）測試新型重組腺病毒疫苗（表達TB多重抗原），用于BCG初免以及病毒載體疫苗加強免疫的牛免疫策略；（2）研發(fā)DIVA（鑒別診斷）試劑，以鑒別疫苗和野毒感染。此外，歐盟食品安全局于2013年向歐盟委員會提出建議，要求開展牛結(jié)核病疫苗的田間試驗[11]。同時，鑒于BCG Danish 1331是歐盟唯一的官方許可疫苗菌株，APHA向英國獸醫(yī)衛(wèi)生主管機構提供了一系列資料，包括該疫苗的安全性和應用數(shù)據(jù)，以獲得該疫苗作為牛結(jié)核病疫苗的獸用許可，同時申請開展田間試驗。