方忠意，李金磊，董 鵬，狄元冉，袁 聰，李紅嬋，高延玲，邱天寶，李夢(mèng)圓，吳志明

（1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州 450008；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 450046）

沙門氏菌（Salmonella）是自然界中普遍存在的人獸共患病原菌。其血清型種類眾多，目前已確認(rèn)的沙門氏菌血清型有2 500多個(gè)。截止到2007年，我國(guó)已檢出322個(gè)沙門氏菌血清型，其中包括國(guó)際新型10余項(xiàng)[1]。沙門氏菌宿主廣泛，不同的血清型對(duì)人和動(dòng)物的致病性不同，且極易在人和動(dòng)物之間水平傳播。沙門氏菌每年給全球食品行業(yè)造成的損失約23億美元，其中接近6%的報(bào)道與豬肉或豬肉產(chǎn)品有關(guān)[2]。我國(guó)90%以上的沙門氏菌食物中毒事件都是肉類食品引起的，而豬肉已被認(rèn)定為主要污染源之一[3]。

目前對(duì)沙門氏菌病的防治主要依賴抗菌藥物，而抗菌藥物的使用導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性日趨嚴(yán)重。本研究通過(guò)河南省豬源沙門氏菌的分離鑒定、血清分型及藥物敏感性試驗(yàn)，以期了解河南省豬源沙門氏菌的血清分布及藥物敏感性情況，為沙門氏菌防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 鼠傷寒沙門氏菌質(zhì)控菌株ATCC14028、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922：購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 樣品來(lái)源 2018年隨機(jī)抽取河南省鄭州市、開(kāi)封市、焦作市、許昌市、漯河市5市生豬屠宰場(chǎng)盲腸內(nèi)容物樣品840份。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板：購(gòu)自BD公司；一次性無(wú)菌采樣棒（BPW）：購(gòu)自鄭州君越科萊特健康科技有限公司；BS瓊脂培養(yǎng)基、TSI瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、swarm半固體瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂：購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏板：購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌診斷血清：購(gòu)自丹麥SSI公司；PCR預(yù)混酶：購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 低溫可疊放搖床：購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；細(xì)菌濁度儀：購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)：購(gòu)自美國(guó)BD公司；臺(tái)式離心機(jī)：購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；梯度PCR儀：購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；凝膠成像系統(tǒng)：購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.1.5 引物 沙門氏菌invA基因引物P1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3′；P2：5′-CATCGCACCGTCAAAGGAAC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為284 bp，退火溫度為60 ℃。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌 使用一次性無(wú)菌采樣棒采集豬盲腸內(nèi)容物，將樣品盡快送往實(shí)驗(yàn)室，35～37 ℃培養(yǎng)16～20 h，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.2.2 樣品的分離、純化 取預(yù)增菌液分別劃線接種于BS和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。在BS上，35～37 ℃培養(yǎng)46～50 h；在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，35～37 ℃培養(yǎng)20～24 h。選取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 PCR鑒定 用滅菌棉簽挑取純化好的菌落，加入裝有1.5 mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中，反復(fù)冷凍煮沸2～3次，12 000 r/min離心，取上清作為PCR擴(kuò)增模板，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，P1、P2 各 1 μL，模板5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。配制 1.5%的瓊脂糖溶液，于微波爐中加熱溶解，待冷卻至50～60℃時(shí)，加入溴化乙錠（使其終濃度達(dá)到0.5 μg/mL）混勻，倒入已插上梳子的膠槽內(nèi)。待凝固后，轉(zhuǎn)入電泳槽中，在每個(gè)泳道中加入8 μL的PCR產(chǎn)物，160 V，電泳15～20 min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。

1.2.4 生化鑒定 從營(yíng)養(yǎng)瓊脂上挑取菌落接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。同時(shí)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂上挑取適當(dāng)菌落，于接種液中調(diào)制菌液濃度至0.5 MCF，然后添加到革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏板，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 血清分型 先測(cè)O抗原，再用無(wú)菌槍頭取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的沙門氏菌，與載玻片上加有10 μL沙門氏菌A—F群“O”多價(jià)診斷血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，于30 s內(nèi)讀取結(jié)果，凝集判為陽(yáng)性，渾濁或清亮判為陰性。同時(shí)設(shè)無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，看細(xì)菌是否有自凝現(xiàn)象。測(cè)完O多價(jià)后，再測(cè)O單價(jià)。測(cè)完O抗原后，測(cè)H抗原，先測(cè)I項(xiàng)：用一次性接種棒將營(yíng)養(yǎng)瓊脂上沙門氏菌輕輕點(diǎn)接到swarm半固體瓊脂中央，注意不要刺破瓊脂，35～37 ℃培養(yǎng)18 h；用無(wú)菌槍頭取swarm半固體瓊脂上的菌落先進(jìn)行HMA、HMB、HMC、HMD多價(jià)測(cè)定，然后進(jìn)行單價(jià)測(cè)定。I項(xiàng)測(cè)定完畢后，選出需要測(cè)II項(xiàng)的，用一次性接種棒，點(diǎn)接在加有相應(yīng)誘導(dǎo)劑的swarm半固體瓊脂上，然后按I項(xiàng)方法進(jìn)行II項(xiàng)的測(cè)定。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的沙門氏菌菌落，用生理鹽水調(diào)制至0.5 MCF，吸取10 μL加入到10 mL肉湯中，然后分別取100 μL加入到96孔藥敏板中，37 ℃培養(yǎng)16～20 h，最后讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng)、樣品分離純化，最后經(jīng)PCR及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，共分離到沙門氏菌45株，分離率為5.36%（45/840）。部分PCR鑒定及生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

2.2 血清分型

分離的45株沙門氏菌中，除2株血清型未定外，其余43株共分為4個(gè)群6個(gè)血清型，分別為B群的Derby（德?tīng)柋?，n=17）、Reading（里定，n=5）、Typhimurium（鼠傷寒變種，n=4），C1群的Rissen（羅森，n=5），C3群的肯塔基（Kentucky，n=11），E1群的London（倫敦，n=1）。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 沙門氏菌部分生化反應(yīng)

圖1 沙門氏菌PCR鑒定結(jié)果

表2 分離的豬源沙門氏菌血清分型

2.3 藥敏試驗(yàn)

將分離菌株進(jìn)行氨芐西林、奧格門丁、頭孢噻呋等16種抗生素藥物敏感性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離的45株沙門氏菌對(duì)四環(huán)素、磺胺異惡唑、大觀霉素、氨芐西林耐藥比較嚴(yán)重，耐藥率分別為82.22%、75.56%、73.33%、73.33%；對(duì)頭孢他啶、美羅培南、安普霉素、乙酰甲喹比較敏感，耐藥率均在10%以下。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3 分析與討論

豬肉是我國(guó)消費(fèi)最多的肉制品，因此對(duì)豬肉品質(zhì)的控制，尤其對(duì)豬源沙門氏菌血清分型和耐藥情況的研究，具有極其重要的公共衛(wèi)生意義。

本研究選取具有代表性的鄭州、開(kāi)封、焦作等市的大型屠宰企業(yè)，進(jìn)行豬源沙門氏菌分離鑒定，共分離出沙門氏菌45株，分離率為5.63%（45/800）。這一結(jié)果與高延玲等[4]從河南省豬屠宰場(chǎng)盲腸內(nèi)容物中研究得出的沙門氏菌分離率（6.9%）接近，比劉鮮鮮等[5]從豬屠宰環(huán)節(jié)研究得出的分離率（19.80%）和沈永恕等[6]從河南省患子宮內(nèi)膜炎母豬中研究得出的分離率（10.83%）要低。這說(shuō)明不同地區(qū)、不同組織中的沙門氏菌污染情況存在差異。

表3 分離沙門氏菌對(duì)16種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)血清凝集法，對(duì)分離的45株沙門氏菌進(jìn)行血清分型，發(fā)現(xiàn)檢出率最高的是德?tīng)柋吧抽T氏菌，其次是肯塔基沙門氏菌、里定沙門氏菌和羅森沙門氏菌。這一結(jié)果與王娟等[7]研究發(fā)現(xiàn)的山東屠宰環(huán)節(jié)豬源沙門氏菌優(yōu)勢(shì)血清型，以及侯小剛等[8]研究發(fā)現(xiàn)的四川豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌優(yōu)勢(shì)血清型一致，均為德?tīng)柋吧抽T氏菌；國(guó)外Denis等[9]也研究表明，種豬和育肥豬場(chǎng)的沙門氏菌血清型以德?tīng)柋吧抽T氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主。上述這些研究結(jié)果表明，德?tīng)柋吧抽T氏菌在整個(gè)養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，世界范圍內(nèi)的豬源沙門氏菌血清型分布有相似性[10]。

通過(guò)肉湯稀釋法，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）最新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判定，發(fā)現(xiàn)分離的沙門氏菌除對(duì)安普霉素和乙酰甲喹全部敏感外，對(duì)其他14種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，尤其對(duì)四環(huán)素、磺胺異惡唑、大觀霉素、氨芐西林耐藥嚴(yán)重，耐藥率均在70.00%以上。分離菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥率與王娟等[7]報(bào)道的80.2%以及侯小剛[8]報(bào)道的89.29%差別不大，而對(duì)大觀霉素、氨芐西林的耐藥率在50%左右，均明顯高于王娟等[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)，也分別高于侯小剛[8]報(bào)道的36.61%、24.11%；對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢噻呋的耐藥率分別為14.4%、31.2%、13.2%，均明顯高于高延玲等[4]報(bào)道的數(shù)據(jù)，而對(duì)氟苯尼考、復(fù)方新諾明、奧格門丁的耐藥率分別為66.4%、60.8%、71.2%，明顯低于其報(bào)道的數(shù)據(jù)。這一結(jié)果表明，不同區(qū)域、不同組織、不同季節(jié)的沙門氏菌耐藥情況存在差異，同時(shí)也表明河南省豬源沙門氏菌耐藥情況較為嚴(yán)重，提示在以后的養(yǎng)殖管理過(guò)程中，應(yīng)加強(qiáng)抗生素的使用監(jiān)管，做到合理用藥、交叉用藥，減少或避免沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生。