鄭勤琴，吳發(fā)興，劉 爽，段 綱，李曉成

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種動(dòng)物共患傳染病[1]，主要感染豬。自然環(huán)境下，牛、綿羊、山羊、貓、犬等家養(yǎng)和野生哺乳動(dòng)物，甚至部分鳥類都對PRV易感。病豬和鼠是PR最主要的傳染源，犬、貓等動(dòng)物為終末宿主[2]。PRV屬雙鏈DNA病毒，是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科成員[3]。1902年Aujeszky首先發(fā)現(xiàn)該病毒，1934年Sabin、Wrght確認(rèn)其為皰疹病毒[4-5]。美國、部分歐洲國家已宣布消滅該病。但在全球其他多數(shù)養(yǎng)豬國家或地區(qū)仍有該病發(fā)生[6]。1947年，該病在我國首次發(fā)生，目前呈地方性流行，危害我國養(yǎng)豬業(yè)，對牛、羊、犬及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖亦有威脅[7-8]。

2011年以來，我國多地豬場陸續(xù)出現(xiàn)仔豬“腹瀉”疫情，部分豬場發(fā)病豬還伴有神經(jīng)癥狀。經(jīng)鑒定，致病原主要為豬流行性腹瀉病毒和PRV[9]。據(jù)報(bào)道，犬、羊、水貂，甚至公園飼養(yǎng)的美洲虎也可感染PRV，并且發(fā)病，甚至死亡[10]。2017年4月，山東省某羊場的個(gè)別山羊出現(xiàn)了依樹磨蹭、磨齒、間歇性煩躁不安等異常表現(xiàn)，2～3 d后出現(xiàn)站立不穩(wěn)、震顫、流涎等神經(jīng)癥狀，隨后突然死亡，當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室診斷為疑似PRV感染。接到樣品后，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了病原分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 病死山羊腦、淋巴結(jié)等組織樣品2份。將樣品剪碎，加適量PBS（pH7.4）混勻，經(jīng)冷凍、劇烈振蕩研磨、離心，回收上清液，濾過除菌后置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基、胰酶、NBS、青霉素-鏈霉素溶液和DNA膠回收試劑盒：均購自Gibco；DNAzol：購自Invitrogen；DL 2 000 bp DNA Marker、GC buffer I、dNTPs、Ex Taq? Hot Start Version、6×loading buffer、50×TAE和瓊脂糖：均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 細(xì)胞和參考病毒株 Marc145細(xì)胞：中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心畜病監(jiān)測室提供；培養(yǎng)基：DMEM溶液加10%新生牛血清、1%青-鏈霉素（終濃度為100 U），常規(guī)方法培養(yǎng)；PRV Min-A株：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔5只：購自青島康大生物科技有限公司。

1.1.5 引物及序列比對用參考毒株 所用PRV野毒株檢測及主要毒力基因（gE、gC和TK）擴(kuò)增引物見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋為20 pmol/L備用。用于序列分析的PRV參考毒株包括Bartha、DUL34Pass、LA、Kaplan、SDWF2、Ea、Becker、SuHV-1、Kolchis、Taian、MinA、Fa、TJ、JS-2012、HN1201、SC 1987、HLJ08、BJ-YT、ZJ01 和Hercules，相應(yīng)毒株的gE、gC和TK基因序列下載自NCBI。

表1 PRV檢測及主要毒力基因擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 兔體接種試驗(yàn) 嚴(yán)格遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》[11]并參考國家標(biāo)準(zhǔn)《偽狂犬病診斷方法》[12]，將5只兔子分成2組，其中攻毒組3只，每只頸部皮下注射1.1.1節(jié)凍存的病料預(yù)處理上清各2 mL，對照組2只，頸部皮下注射PBS 2 mL，隔離飼養(yǎng)觀察。試驗(yàn)結(jié)束后，對死亡家兔尸體進(jìn)行無害化處理，并對試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。

1.2.2 病毒分離培養(yǎng) 取凍存的病料上清液，接種于長至單層的Marc145細(xì)胞，1 h后加入約4 mL含1%血清和1%雙抗的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)立一組未接種病料的細(xì)胞作為陰性對照，每隔8 h觀察細(xì)胞病變情況。待接種48～72 h后收獲病毒，然后連續(xù)盲傳5個(gè)代次，收集每一代次全部培養(yǎng)物，分別將其命名為SDPD-17第F1、F2、F3、F4、F5代，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測及基因擴(kuò)增用核酸提取 取參考毒株 MinA、SDPD-17 F1～F5 代培養(yǎng)物各 250 μL，按DNAzol使用說明書提取全基因組，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)物PCR檢測 在冰上配置細(xì)胞培養(yǎng)物PRV檢測體系，總體系為25 μL，分別包括 2×GC 緩沖液 12.5 μL、dNTPs 2 μL，gE-TF 和gE-TR（20 pmol/L）各 0.5 μL，EX-Taq 熱啟動(dòng)聚合酶 0.25 μL、模板 2 μL、DEPC 水 7.25 μL。檢測條件是：98 ℃熱變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，即 94 ℃ 50 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min，結(jié)束后取適量產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察。

1.2.5 電鏡觀察 取SDPD-17分離株F5代培養(yǎng)物（下同）送青島大學(xué)院電鏡室進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.6 病毒效價(jià)測定 待Marc145細(xì)胞長至單層后，經(jīng)胰酶消化制作96孔細(xì)胞板，取SDPD-17株細(xì)胞毒連續(xù)進(jìn)行10倍系列稀釋，依次接種細(xì)胞板各孔，按Reed-Muench法進(jìn)行病毒效價(jià)測定。

1.2.7 PRV分離株遺傳演化分析 取表1中的PRV主要毒力基因gE、gC、TK擴(kuò)增引物，按照細(xì)胞培養(yǎng)物PCR檢測體系分別配制3個(gè)基因的擴(kuò)增體系，體系大小均為50 μL，基因擴(kuò)增條件與PRV野毒檢測條件大致相同，gE、gC、TK基因的退火溫度分別是62、61、63 ℃。擴(kuò)增結(jié)束后，取適量產(chǎn)物，鑒定是否出現(xiàn)目的條帶。如果有目的條帶，切膠后按DNA膠回收試劑盒使用說明書回收目的條帶，送樣測序；收到測序結(jié)果后，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行分離株遺傳演化分析。

2 結(jié)果

2.1 兔體接種試驗(yàn)

兔體接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3只家兔在接種病料處理上清后，48 h左右出現(xiàn)奇癢、尖叫和撕咬注射部位等癥狀，72 h內(nèi)全部死亡。死亡家兔的注射部位血肉模糊，尸體呈角弓反張樣（圖1-A），而對照兔無任何臨床異常（圖1-B）。

圖1 兔體接種試驗(yàn)中的兔臨床癥狀

2.2 病毒分離

Marc145細(xì)胞接種病料處理上清液后，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，12 h左右細(xì)胞出現(xiàn)病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增強(qiáng)，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡或呈“包涵體”樣（圖2），36 h左右細(xì)胞脫落，此時(shí)收獲病毒培養(yǎng)液。從第2代開始，CPE出現(xiàn)的時(shí)間提前至接種后8 h，24 h左右便可收獲。繼續(xù)傳代到第5個(gè)代次，對每個(gè)代次的培養(yǎng)物做好標(biāo)記，低溫保存待檢。

圖2 SDPD-17接種Marc145后的細(xì)胞病變（200×）

2.3 病毒鑒定

提取PRV參考毒株和SDPD-17株F1～F5代培養(yǎng)物全基因組，進(jìn)行PRV野毒PCR鑒定。結(jié)果凝膠電泳鑒定均為PRV gE核酸陽性，即所分離毒株為PRV（圖3）。

圖3 PRV SDPD-17株P(guān)CR檢測電泳圖

2.4 電鏡觀察

將SDPD-17 F5代細(xì)胞毒液4 ℃ 12 000 g離心10 min后，吸取上清液送至青島大學(xué)附屬醫(yī)院電鏡室進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察。在電子顯微鏡下可見，直徑約150 nm的病毒粒子。該病毒粒子呈球形，隱約可見四層結(jié)構(gòu)，最外層是典型的脂質(zhì)雙分子層膜形成的囊膜（圖4）。

圖4 SDPD-17 病毒粒子電鏡照片

2.5 病毒含量測定

待SDPD-17 F5代細(xì)胞毒接種Marc145細(xì)胞3～5 d后，測定該病毒的TCID50值為10-7.50/0.1 mL，即該病毒稀釋107.50。接種100 μL，可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。

2.6 gE、gC、TK基因測序及遺傳演化分析

2.6.1 gE、gC、TK基因測序 經(jīng)擴(kuò)增、電泳、切膠回收、測序后，獲得了SDPD-17毒株gE、gC、TK基因片段，各序列長分別為1 740、1 460、951 bp（圖5）。

2.6.2 gE基因遺傳演化分析 將19個(gè)參考毒株與SDPD-17株的gE基因進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)分離毒株與Kaplan等5個(gè)國外毒株的gE基因和氨基酸序列同源性介于97.7%～98.0%、94.3%～96.0%，與MinA等3個(gè)國內(nèi)毒株gE基因和氨基酸序列同源性介于 98.9%～99.8%、98.3%～100%。應(yīng)用MEGA6.0軟件成功構(gòu)建gE基因遺傳發(fā)育進(jìn)化樹（圖6），分析發(fā)現(xiàn)該分離毒株與當(dāng)前國內(nèi)流行的PRV毒株位于同一進(jìn)化分支，均屬于G2基因型的G2.3分支。

圖5 PRV SDPD-17株gE、gC、TK基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.6.3 gC基因遺傳演化分析 將19個(gè)參考毒株與SDPD-17株的gC基因序列進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)分離毒株與Kaplan等5個(gè)國外毒株的gC基因和氨基酸序列同源性介于95.9%～96.2%、93.1%～93.5%，與MinA等3個(gè)國內(nèi)毒株gE基因和氨基酸序列同源性介于96.9%～100%、94.8%～100%。應(yīng)用MEGA6.0軟件，成功構(gòu)建gC基因遺傳發(fā)育進(jìn)化樹（圖7）。分析發(fā)現(xiàn)，該分離毒株與當(dāng)前國內(nèi)流行的PRV毒株位于同一進(jìn)化分支，均屬于G2基因型的G2.3，無明顯地域和時(shí)間差異。

圖6 SDPD-17株gE基因構(gòu)建的遺傳發(fā)育進(jìn)化樹

圖7 SDPD-17株gC基因的遺傳發(fā)育進(jìn)化樹

2.6.4 gE、gC、TK基因氨基酸變異分析 將SDPD-17株gE、gC、TK基因序列轉(zhuǎn)換為推導(dǎo)氨基酸序列后，與19個(gè)參考毒株的gE、gC、TK基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)相較于國外PRV毒株，該分離毒株和國內(nèi)參考毒株的gE糖蛋白的主要變化特點(diǎn)為48、497位各插入了1個(gè)天冬氨酸（D），另在gE糖蛋白的54、59、63、106、122、149、179、181、215、216、472、474位發(fā)生了氨基酸變異。比較gC蛋白推導(dǎo)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)相較于國外PRV毒株，該分離毒株和國內(nèi)參考毒株gC糖蛋白的主要變化特點(diǎn)為64～70位插入了7個(gè)氨基酸（AASTPAA），另外gC糖蛋白的 16、25、43、53、55、57、59～61、76、87、90、102、130、142、187、240、243、431、437、449、457、461、467、485～487位發(fā)生了氨基酸變異。該分離毒株與參考毒株的TK基因推導(dǎo)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該分離毒株與國內(nèi)毒株TK氨基酸序列除在215位發(fā)生1個(gè)位點(diǎn)突變外（T→V），其他位點(diǎn)均未改變。

3 討論

從疑似PRV感染的山羊腦、淋巴結(jié)樣品中分離到1株P(guān)RV，綜合兔體接種、病毒分離、系列鑒定及相關(guān)基因測序分析，確定分離的病毒屬PRV野毒（gE基因不缺失）。直接使用病料處理上清液攻擊易感動(dòng)物家兔，可使其出現(xiàn)奇癢、撕咬注射部位、尖叫等PRV感染所致的經(jīng)典癥狀；Marc145細(xì)胞接種后可產(chǎn)生變大、變亮、拉網(wǎng)等典型細(xì)胞病變特征，gE、gC等基因測序結(jié)果也證實(shí)細(xì)胞分離物為PRV。因此，可以確認(rèn)PRV是導(dǎo)致山羊發(fā)病死亡的主要致病原。該試驗(yàn)結(jié)果與郭榮利等[13]、孫海鳳等[14]和朱玲云等[15]的研究結(jié)果一致。

將國內(nèi)外PRV毒株gE、gC、TK基因與該分離株SDPD-17進(jìn)化樹、序列同源性以及氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，這株山羊源PRV與近幾年來分離到的豬源、犬源PRV的核苷酸序列同源性介于96.5%～100%，在物種和地域上幾乎不存在差異。因此，推測該毒株可能由豬體通過媒介（鼠、犬）傳染給了山羊[16]。比對gE基因推導(dǎo)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該毒株gE糖蛋白的48、497位各插入了1個(gè)D，另在gE糖蛋白的12個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變。而比對該株與國外毒株gC蛋白發(fā)現(xiàn)，在64～70位插入了7個(gè)氨基酸（AASTPAA）。Wang等[17]的研究結(jié)果亦如此，說明該毒株與我國當(dāng)前流行的PRV屬于同一基因型（G2.3）。

為加強(qiáng)對PRV的控制，各養(yǎng)殖場應(yīng)避免多種動(dòng)物混養(yǎng)，優(yōu)化養(yǎng)殖場生物安全管理制度，做好定期消毒及疫苗免疫工作。同時(shí)，在我國豬群PR地方流行，應(yīng)同時(shí)加強(qiáng)對山羊等對PRV敏感動(dòng)物的PR流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測以及免疫預(yù)防工作。