鄭飛云 ， 鈕成拓 ， 朱林江 ， 唐棟健 ，李永仙 ， 劉春鳳 ， 王金晶 ， 李 崎 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；4.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江杭州 310014）

近些年，啤酒企業(yè)通過生產(chǎn)設(shè)備的更新?lián)Q代，能有效地減少微生物污染事件，但是，微生物污染事件仍難以避免，而且對(duì)發(fā)酵過程以及終端產(chǎn)品的污染菌進(jìn)行有效監(jiān)控依舊是必不可少的[1]。然而，對(duì)這些污染菌的監(jiān)控一直是啤酒工業(yè)的瓶頸問題，目前主要沿用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測(cè)方法。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)基檢測(cè)方法存在以下2方面不足[2]:第一，常用的微生物監(jiān)控方法是富集培養(yǎng)基的方法，一般需要1周的時(shí)間，所以污染菌的檢測(cè)結(jié)果具有嚴(yán)重的滯后性；第二，污染菌種類多樣，菌株之間的腐敗性能差異很大，啤酒腐敗菌是從啤酒生產(chǎn)過程和環(huán)境中篩選而來，部分菌株具有較強(qiáng)啤酒腐敗能力，而部分菌株能夠存活但并不能腐敗啤酒，其具有轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)啤酒腐敗能力菌株的潛力。因此，用培養(yǎng)基方法難以快速鑒定菌株的腐敗性能，若采用傳統(tǒng)的植菌實(shí)驗(yàn)方法，則需要花費(fèi)1個(gè)月的時(shí)間。為了能夠更加有效地監(jiān)控污染菌，針對(duì)啤酒腐敗菌的分子生物學(xué)的特征已有大量的研究，比如特征的酒花抗性基因[3-4]、具有較強(qiáng)腐敗能力的菌株的表面抗原[5-6]、乳酸脫氫酶的特征電泳特性[7]、菌株質(zhì)譜指紋特征[8]等。

酒花抗性是被研究最多的啤酒污染菌的典型特征。酒花中的苦味物質(zhì)，是一種弱酸，在酸性的啤酒環(huán)境中，其未解離形式能夠自由穿梭許多細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，消除了胞內(nèi)外的pH梯度，從而抑制或殺死細(xì)菌[9-10]。然后，少量細(xì)菌，通過適應(yīng)性進(jìn)化，能夠克服酒花苦味物質(zhì)毒性，在啤酒環(huán)境中繁殖，腐敗啤酒的風(fēng)味口感，影響啤酒生產(chǎn)。就現(xiàn)代啤酒釀造工廠而言，這類具有腐敗能力的污染菌主要是乳桿菌屬（Lactobacillus spp.），如典型的短乳桿菌（L.brevis）、植物乳桿菌（L.plantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）、布式乳桿菌（L.buchneri）以及林氏乳桿菌（L.lindneri）等。此外在這些菌種中，不同的菌株，其腐敗能力差異顯著。所以，為了更有效地監(jiān)測(cè)腐敗啤酒的菌株，有必要對(duì)各個(gè)菌株的基因型多樣性進(jìn)行比較分析。

目前的研究表明，有些啤酒腐敗菌的酒花抗性與ABC（ATP-bindingcassette）家族的多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 HorA[3]和 RND（resistance-nodulation-cell division）家族的多藥物抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HorC[11]。HorA是第1個(gè)被證明與酒花抗性相關(guān)的蛋白，位于L.brevis ABBC45的內(nèi)源質(zhì)粒上[3]，用二維電泳圖譜分析確定為酒花苦味物質(zhì)誘導(dǎo)型表達(dá)[12]。另一個(gè)與酒花抗性相關(guān)的基因是horC，也是在內(nèi)源質(zhì)粒上，若缺失該基因，則顯著降低宿主菌株的酒花抗性，而過量表達(dá)該基因，可提高菌株的酒花抗性[11，13]。但是，仍缺乏這些基因與酒花抗性相關(guān)的直接證據(jù)。若將horA/horC作為跨種基因標(biāo)記檢測(cè)啤酒污染菌，結(jié)果表明在被研究的大部分腐敗菌株中，其PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，不過，也有一些非腐敗菌株，其擴(kuò)增結(jié)果為陽性，即horA/horC的檢測(cè)具有較高的假陽性率[14-15]。此外，以上實(shí)驗(yàn)菌株的基因型未被研究[13]，其菌株的基因型多樣性未知，菌株之間的差異難以判斷。所以，horA/horC與多樣性的啤酒污染菌菌株的相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。本次研究，針對(duì)來自5家啤酒廠分離的53株啤酒污染菌，研究菌株的PCR指紋多樣性、表型多樣性與酒花抗性基因型多樣性之間關(guān)系，從而為啤酒污染菌有效監(jiān)控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

本次研究所使用的啤酒污染菌，為實(shí)驗(yàn)室保藏，來自國內(nèi)長(zhǎng)三角地區(qū)的多個(gè)不同啤酒廠的生產(chǎn)車間、釀造過程以及終端污染的產(chǎn)品。這些菌株經(jīng)過16SrDNA測(cè)序鑒定，主要屬于乳桿菌屬。菌株的培養(yǎng)條件:采用MRS培養(yǎng)基或添加了四氫異-α-酸的MRS培養(yǎng)基，在28℃，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。厭氧環(huán)境:培養(yǎng)皿的培養(yǎng)在厭氧罐中；液體培養(yǎng)在厭氧管或厭氧瓶中。

1.2 PCR指紋擴(kuò)增及聚類分析

DNA提取:將各個(gè)菌株活化并接種到MRS液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)；3 000 g離心5 min收集細(xì)胞；將收集的細(xì)胞用于DNA提取，采用之前報(bào)道的CTAB法；提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

PCR指紋擴(kuò)增:采用指紋擴(kuò)增的M13引物，其序列為:5’-GAG GGT GGC GGT TCT-3’。其擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下 （25 μL）:2.5 μL 的 10×PCR buffer，2 μL的 mmol/L dNTP，5 U 的 μL Taq聚合酶，4 μL 的25 mmol/L M13 引物，2 μL 的 DNA 模板，13.9 μL的雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序如下:94℃變性3 min，42℃退火2 min，72℃延伸3 min，然后30個(gè)循環(huán)，94℃，45 s；42 ℃，40 s；72 ℃，120 s。 然后 72 ℃延伸 10 min后12℃保溫。15 μL的PCR產(chǎn)物用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，以GoldView為染料，通過凝膠成像儀獲得PCR擴(kuò)增指紋圖譜。

PCR指紋的聚類分析:PCR指紋圖譜采用Applied Maths公司的GelComparⅡ軟件處理，選用Pearson系數(shù)計(jì)算指紋的相似性，并用UPGMA（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic averages）方法構(gòu)建距離樹。

1.3 酒花苦味物質(zhì)抗性分析

首先采用MRS培養(yǎng)基活性菌株:將保藏管中的啤酒污染菌接入裝有20 mL MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中進(jìn)行活化，接種量為5 g/dL，30℃下厭氧培養(yǎng)24～48 h；轉(zhuǎn)接活化細(xì)胞到新鮮的20 mL MRS中，相同條件下厭氧培養(yǎng)12～24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期；通過培養(yǎng)皿背面標(biāo)記均分涂布區(qū)域:將方形梯度平板分為6塊平行區(qū)域；每一塊區(qū)分平均分為6個(gè)小格，從低濃度端開始依次將每個(gè)小格標(biāo)記為格子1#-格子6#；取10 μL的培養(yǎng)液，均勻滴加到酒花梯度平板的相應(yīng)位置；用涂布棒在平板的固定區(qū)域涂布均勻，并使培養(yǎng)液被吸干；在28℃，厭氧罐中，培養(yǎng)3-5 d；觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。各個(gè)四氫異-α-酸最小抑制濃度（MIC）的計(jì)算如以下公式（1）所示。

其中MIC為菌株的四氫異-α-酸的最小抑制濃度；C高為高質(zhì)量濃度一端的四氫異-α-酸的質(zhì)量濃度；C低為低質(zhì)量濃度一端的四氫異-α-酸的質(zhì)量濃度；6為每個(gè)菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基平板上平均分為6格；n為實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的格子數(shù)。

1.4 酒花抗性基因horA和horC的擴(kuò)增

以PCR指紋擴(kuò)增中提取的DNA為模板，對(duì)各個(gè)菌株的horA和horC進(jìn)行擴(kuò)增。horA基因擴(kuò)增引物為:horA-F（5′-ATCCGGCGGTGGCAAATC-3′）和horA-R（5′-AATCGCCAATCGTTGGCG-3′），擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為324 bp。horC基因的擴(kuò)增引物為:horCF （5′-GTCAACGAAGACAAAGGAGCTCTC-3′）和horC-R（5′-GGGCGAACCGTGAACAAATAG-3′），擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為1 116 bp。

基因horA和horC的擴(kuò)增反應(yīng)體系均如下（50 μL）:5 μL 的 10×PCR buffer，1 μL 的 10 mmol/L 的dNTP，5 μL 的 25 mmol/L 的 MgCl2，5 U 的 Taq 聚合酶， 上下游的 10 mmol/L 的引物各 0.5 μL，2 μL 的DNA模板，36.5 μL雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序如下:94℃變性 3 min，然后 30個(gè)循環(huán)，94 ℃，45 s；61 ℃，40 s；72℃，30 s。然后 72℃延伸5 min后 12℃保溫。PCR產(chǎn)物采用1 g/dL的瓊脂糖凝膠分離，并用GoldView染料，在凝膠成像儀中顯色。

1.5 腐敗啤酒能力分析

啤酒污染菌的腐敗啤酒能力采用傳統(tǒng)植菌實(shí)驗(yàn)，即將活化細(xì)胞直接接種到12°P脫氣啤酒，其步驟如下:

1）菌株活化:將保藏管中的啤酒污染菌接入裝有20 mL MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中進(jìn)行活化，接種量為體積分?jǐn)?shù)5%，30℃下厭氧培養(yǎng)24~48 h；轉(zhuǎn)接活化細(xì)胞到新鮮的20 mL MRS中，相同條件下厭氧培養(yǎng)3 d，使細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期。

2）啤酒培養(yǎng)基制備:對(duì)成品啤酒進(jìn)行巴氏消毒，開蓋用滅菌紗布包好靜置2 d除氣；將啤酒分裝入已滅菌的厭氧管中，每管20 mL。

3）接種活化細(xì)胞:將已活化的菌液接入啤酒中，接種量為體積分?jǐn)?shù)1%，初始細(xì)胞濃度約為106CFU/mL，25℃下培養(yǎng)1個(gè)月。能使啤酒變渾濁的即為啤酒腐敗菌，并取200 μL通過96孔板測(cè)定最終OD600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒污染菌M13-PCR指紋的擴(kuò)增

從實(shí)驗(yàn)室保藏的啤酒污染菌資源庫中，挑選來自5個(gè)啤酒工廠環(huán)境或釀造樣品中分離的53株污染菌。為了分析不同菌株之間的基因型差異，對(duì)其進(jìn)行M-13指紋的擴(kuò)增。M-13引物是根據(jù)細(xì)菌基因組中保守的微衛(wèi)星核心序列，通過PCR擴(kuò)增，得到多種不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，形成特征性指紋圖譜[16]。M13-PCR指紋較為復(fù)雜，不同類型的指紋，代表不同的菌株，具有菌株專一性的特征；此外該指紋具有良好的重復(fù)性，可用于菌種的鑒定[17-18]。

對(duì)53株菌株的M13-PCR進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。這些菌種包括L.plarntarum（lpl）、L.brevis（lbr）、L.casei（lca）、L.rossiae（lro）、L.lactis（lbla）、L.paracasei（lpa） 和 L.manihotivorans（lma）。除了lpa 2-9-5和lpl 6-12-4，不同菌種之間，其指紋相似性均小于70%（圖1和圖2）。然而同屬一種菌，但不同菌株之間指紋相似性差異較大，如來自不同啤酒廠的lpl 2-5-1和lpl 3-13-1，其指紋的相似性達(dá)到了90%；而來自同一家工廠的lpl 2-5-1和lpl 2-13-1的相似性只有28%（圖1）。若是來自同一家工廠，同時(shí)具有非常相似的M13指紋，則可初步認(rèn)為同一株菌株。所以，根據(jù)指紋菌類分析，53株菌的M13-PCR指紋相差較大，表明其基因型各不相同，具備一定的多樣性。

圖1 啤酒腐敗菌M13-PCR聚類分析及其生理特征Fig.1 Clustering analysis of M13-PCR results and biochemical properties of spoilage microbes which can grow in beer

圖2 非啤酒腐敗菌的M13-PCR聚類分析及其生理特征Fig.2 Clustering analysis of M13-PCR results and biochemical properties of spoilage microbes which cannot grow in beer

2.2 酒花苦味物質(zhì)抗性的分析

為了快速分析各個(gè)菌株的酒花抗性能力，采用四氫異-α-酸梯度質(zhì)量濃度的MRS平板，其質(zhì)量濃度為0~0.5 g/L之間變化，如圖3所示。將新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞涂布于新鮮制作的梯度平板，經(jīng)過厭氧培養(yǎng)后，根據(jù)生長(zhǎng)菌膜的長(zhǎng)度，計(jì)算各個(gè)菌株的四氫異-α-酸最小抑制濃度（MIC）。質(zhì)量濃度梯度是依賴四氫異-α-酸的擴(kuò)散形成，其制作過程要求2種高低質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基體積均等，同時(shí)下層培養(yǎng)基保持固定傾斜角度，平板的干燥和保存時(shí)間保持一致性。所有53株菌通過梯度平板法分析的四氫異-α-酸MIC如圖1和圖2所示，各個(gè)菌株的MIC在0.05~0.5 g/L之間不等，能夠有效區(qū)分不同菌株之間的酒花抗性強(qiáng)弱，即可分為弱 （0.05~0.1 g/L）、中（0.11~0.29 g/L）、強(qiáng)（0.3~0.5 g/L）3 種。

圖3 四氫異-α-酸梯度平板分析菌株的酒花抗性Fig.3 Analysis of the hop resistant ability of strains through gradient hop agar plates

2.3 啤酒腐敗能力的比較分析

啤酒污染菌的腐敗性，是指在啤酒環(huán)境中能夠生長(zhǎng)繁殖，從而對(duì)啤酒的生物安全性和啤酒風(fēng)味口感構(gòu)成威脅，是污染菌的一個(gè)重要生理表型。其腐敗啤酒能力采用傳統(tǒng)的植菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，即將新鮮活化的菌株接種到啤酒中，厭氧培養(yǎng)1個(gè)月，分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況。由于啤酒環(huán)境存在多種脅迫，包括含有酒花苦味物質(zhì)、低pH的酸性環(huán)境、含量較少的營養(yǎng)物質(zhì)、一定濃度的酒精等，所以細(xì)菌在啤酒中生長(zhǎng)速率緩慢，且大部分細(xì)菌難以生長(zhǎng)。針對(duì)53株啤酒環(huán)境分離的菌株，分析其在12°P啤酒中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表1所示。根據(jù)96微孔板測(cè)定的OD600值，將各個(gè)菌株的腐敗啤酒性能分為無（-）、弱（+）、中（++）和強(qiáng)（+++）4 種。 其中，無腐敗性的菌株為28株，弱的腐敗性的菌株17株，而中和強(qiáng)的腐敗性菌株各為2株和6株，所以各個(gè)菌株的腐敗性存在顯著差異。

表1 啤酒污染菌的腐敗能力統(tǒng)計(jì)表Table 1 Summary of beer spoilage ability of spoilage microbes

2.4 酒花抗性基因的擴(kuò)增

horA和horC也已被作為跨種基因標(biāo)記，檢測(cè)啤酒腐敗菌。對(duì)53株啤酒污染菌的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，如圖4所示。其中圖2（a）為horA檢測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為324 bp，圖2（b）為horC的檢測(cè)結(jié)果，片段長(zhǎng)度為1 116 bp。結(jié)果表明L.plantarum 1-5-2和L.zymae 2-1-4的horA和horC檢測(cè)均為陰性，L.plantarum 1-8-2的horA擴(kuò)增較弱，但是擴(kuò)增片段的大小一致。所有53株菌的檢測(cè)結(jié)果總結(jié)在圖1和圖2中。

圖 4 horA（A）與 horC（C）基因擴(kuò)增Fig.4 PCR results of horA and horC

2.5 啤酒污染菌基因型和表型多樣性分析

為了分析啤酒污染菌基因型與表型的相關(guān)性，總結(jié)并比較分析53株菌的基因型和表型，如圖1和圖2所示。首先根據(jù)腐敗啤酒的能力，將菌株分為腐敗菌與非腐敗菌；其次將菌株的M13-PCR指紋通過GelCompar II軟件進(jìn)行聚類分析；再者，將菌株的來源工廠、腐敗啤酒能力、酒花抗性能力、horA和horC擴(kuò)增結(jié)果等信息進(jìn)行總結(jié)和比較分析。

酒花抗性相關(guān)基因與酒花抗性能力、腐敗啤酒能力之間關(guān)系如表2所示。其中，horA/horC擴(kuò)增陽性，表示horA或horC擴(kuò)增為陽性，該P(yáng)CR檢測(cè)結(jié)果被認(rèn)為與啤酒腐敗菌有密切關(guān)系，同時(shí)存在一定的假陽性率。本次研究結(jié)果表明，在28株腐敗菌中，有22株菌的horA/horC擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其假陽性率高達(dá)78.6%，而25株非腐敗菌中，有7腐敗能力較弱的菌株，其horA/horC擴(kuò)增結(jié)果為陰性，即假陰性率28%。不過，在腐敗能力較強(qiáng)的8株菌株中，horA/horC擴(kuò)增均為陽性，即腐敗能力較強(qiáng)菌株含有horA或horC。horA/horC與菌株的酒花抗性能力相關(guān)分析表明，14株酒花抗性較強(qiáng)的菌株中有13株含有horA/horC，表明酒花抗性較強(qiáng)的菌株一般含有horA或horC。不過，12株酒花抗性較弱的菌株中，有7株菌含有horA或horC；而酒花抗性為中等強(qiáng)度的27株中，有7株菌不含horA和horC。所以，horA/horC的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，具有較高的假陽性率和一定的假陰性率，不能充分鑒定菌株的腐敗啤酒能力和酒花抗性能力，然而菌株的horA/horC基因在胞內(nèi)的實(shí)際表達(dá)水平有待進(jìn)一步研究。此外，有些菌株具有較強(qiáng)酒花抗性，但horA和horC的擴(kuò)增均為陰性，如具有腐敗能力的L.lactis 1-6-2和不具有腐敗能力的L.casei 2-12-1，這些菌株中可能存在新的酒花抗性機(jī)制。

horA/horC擴(kuò)增與菌種的關(guān)系進(jìn)行比較分析，其中菌種選擇含有4株及以上數(shù)量的菌種，結(jié)果如表3所示。本次選擇的53株菌，主要是L.plantarum，共 27 株；其次是 L.casei/paracasei（9 株）、L.brevis（8 株）、L.lactis（4 株）。 在這些菌種中，L.plantarum的horA/horC擴(kuò)增陽性率最高，達(dá)到了96.3%，顯著高于其它3種菌，即horA/horC在L.plantarum具有較高的保守性。

表2 horA/horC擴(kuò)增與污染菌的啤酒腐敗能力和酒花抗性能力之間的關(guān)系Table 2 Relationship among horA/horC genes，beer spoilage ability and hop resistance ability

表3 horA/horC擴(kuò)增與污染菌菌種的關(guān)系Table 3 Relationship between horA/horC and spoilage bacteria strains

3 結(jié)語

啤酒污染菌對(duì)啤酒的生產(chǎn)安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性構(gòu)成威脅，對(duì)其有效監(jiān)控是必不可少的環(huán)節(jié)。為了能夠快速有效地監(jiān)測(cè)啤酒腐敗菌，horA/horC已被作為跨種基因標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增監(jiān)測(cè)啤酒污染菌。為了分析horA/horC檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本次研究針對(duì)來自5家啤酒廠的53株啤酒污染菌進(jìn)行基因型和表型的比較分析。通過M13-PCR指紋的聚類分析表明，不同菌種的指紋相似性一般小于70%，同一菌種的不同菌株，其指紋也存在較大差異，表明53株啤酒污染菌具有豐富的基因型，個(gè)體差異顯著。通過植菌實(shí)驗(yàn)分析了各個(gè)菌株的腐敗啤酒能力和通過四氫異-α-酸梯度平板快速分析菌株的酒花抗性，并對(duì)horA/horC進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。比較各個(gè)菌株的基因型和表型表明，腐敗能力較強(qiáng)和酒花抗性較強(qiáng)的菌株，horA/horC的檢測(cè)結(jié)果一般為陽性；但很多沒有腐敗啤酒能力的菌株，也是horA/horC檢測(cè)陽性，假陽性率高達(dá)78.%；少量具備弱腐敗能力的菌株，其檢測(cè)為陰性，即假陰性率為28%；部分較弱酒花抗性菌株的horA/horC擴(kuò)增為陽性，不過這些基因的胞內(nèi)表達(dá)水平有待進(jìn)一步研究；2株較高酒花抗性菌株的horA/horC擴(kuò)增為陰性，可能存在新的酒花抗性機(jī)制。此外，通過菌種間的比較分析表明，盡管horA/horC在L.bevis中被發(fā)現(xiàn)，但卻在L.plantarum中具有較高的保守性。在后續(xù)研究中，擬通過進(jìn)一步PCR擴(kuò)增得到所有菌株horA和horC基因全長(zhǎng)序列，分析其序列突變及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化與其酒花苦味物質(zhì)抗性之間的關(guān)系。