高分辨質譜快速篩查牛乳中10種禁用獸藥殘留

貢松松，張婧，嚴鳳，吳劍平，潘娟，盧洪秀

（1.上海市獸藥飼料檢測所，上海201103；2.上海農林職業(yè)技術學院農業(yè)生物與生態(tài)技術系，上海201600）

0 引 言

由于現(xiàn)代農業(yè)中獸藥的大規(guī)模使用，牛乳中抗生素和激素的殘留受到廣泛關注。歐盟對獸藥殘留限量作了嚴格規(guī)定[1]。我國為加強獸藥殘留監(jiān)控，也對此作了嚴格規(guī)定[2]。有研究表明，兒童性早熟，男性前列腺癌，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與食品中雌激素（Estrogens）的殘留有關[3-5]。氯霉素類(Chloramphenicols)藥物通過食物鏈進入人體，則會對人體造血機能產生嚴重的副作用[6-7]。

牛乳中雌激素和氯霉素常用的檢測方法有氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)[8]和液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS)[9-10]。GC-MS雖然分離效果好，但是雌激素需要衍生化，操作繁瑣。以四級桿-飛行時間質譜為代表的高分辨質譜既可以獲得分子離子信息，又能獲得豐富的碎片離子信息。因此，其成為多殘留的有效分析方法[11-12]。本文借鑒QuEChERS[13-16]方法在多殘留前處理方面的優(yōu)勢，建立了生鮮牛乳中10種禁用獸藥的快速篩查方法。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純），甲酸（色譜純），乙酸（分析純），無水硫酸鈉，氯化鈉（分析純），乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），十八烷基硅烷（ODS C18），超濾離心管（3ku），實驗用水為超純水。

氯霉素標準品(Chloroamphenicol,CAP)，甲砜霉素標準品(Thiamphenicol,TAP)，氟苯尼考標準品(Florfenicol,FF)，雌酮標準品(Estrone,E1)，己烷雌酚標準品(Hexestrol,HES)，炔雌醇標準品(Ethinylestradiol,EE2)，雌三醇標準品(Estriol,E3)，己烯雌酚標準品(Diethylstilbestrol,DES)，雌二醇標準品(Estradiol,E2)，雙烯雌酚標準品(Dienestrol,DIE)，純度均大于96.1%。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜（6530），包括G4220A流動相輸送泵，G4226A自動進樣器，G1316C柱溫箱，G4212A二極管陣列檢測器；Mass-Hunter數據處理系統(tǒng)，AE240電子天平，Allegra X-22R高速冷凍離心機，多管漩渦振蕩器，Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.3 標準溶液的配制

標準品貯備液：稱取10 mg標準品（根據純度折算質量），用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，制成質量濃度為1mg/mL的單標貯備液。對于每類化合物，將單標溶液混合制成50或質量濃度為100 μg/mL的混合標準溶液，使用時再根據需要混合或稀釋，這些混合標準溶液用來制備標準曲線和質量控制樣品。將配制好的標準品貯備液置于4℃環(huán)境下低溫避光保存。

1.4 樣品前處理

準確稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋震蕩4 min，轉速為8 000 r/min離心5 min。準確移取10 mL上層清液于離心管中，加入1.0 g無水硫酸鈉，0.2 g PSA，渦旋振蕩器振蕩4 min，轉速為8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于40℃氮氣吹至近干，用1.0 mL乙腈-水溶液（5∶95，體積比）定容，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜測定。

1.5 超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0 min，5%B；2 min，5%B，2～4 min，5%～40%B；4～9 min，40%～80%B；9～9.5 min，80%～95%B；9.5～15 min，95%～95%B；15～17 min，95%～5%B；17～20 min，5%B；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

1.5.2 質譜條件

離子源為Dual AJS ESI，負離子模式；掃描范圍為50～1000 m/z；干燥氣溫度為320℃；干燥氣流速為8 L/min；霧化器壓力為0.24 MPa；鞘氣溫度為400℃；鞘氣流速為12 L/min；毛細管電壓為3 000 V；噴嘴電壓為500 V；碎裂電壓為130 V；飛行時間管真空度為2.04×10-7；儀器在高分辨率（4 GHz），低質量范圍（＜m/z 1700）下操作。10種雌激素類和氯霉素類藥物的質譜分析參數和提取離子色譜圖分別如表1所示。

1.6 篩查譜庫的建立

取合適濃度的混合標準品工作液稀釋到質量濃度為1 mg/L，在優(yōu)化好的色譜質譜條件下進樣，先進行一級質譜掃描，得到目標藥物的保留時間、質子化的分子質量數、質量誤差等信息。在不同的碰撞電壓下再進行二級質譜掃描，得到目標化合物的二級全掃描圖及質譜碎片信息，以此建立10種雌激素類和氯霉素類藥物的篩查譜庫。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

實驗比較了SB C18（3.0 mm ×100 mm，1.8 μ m）、SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）和Extend C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）3種色譜柱對10種雌激素類和氯霉素類藥物的分離度和檢測靈敏度的不同影響。實驗表明，ZORBAX SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱更適合分析目標藥物，內徑越小，峰形越尖銳對稱。雖然5 cm色譜柱用時更短，但不能保證每種藥物都有良好的峰形，在粒徑相同的情況下，采用內徑更小的10 cm色譜柱，結合高分辨質譜的優(yōu)異性能，能獲得良好的分離度。

2.1.2 流動相的選擇

本實驗考察不同pH的水系流動相（水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液）對目標藥物在色譜柱上分離效果的影響。結果表明，流動相加入甲酸或乙酸后，峰形較差。當使用超純水時，目標藥物的離子化效率較好，分離效果令人滿意。故選擇乙腈和水作為流動相，采用梯度洗脫方式可以很好地將10種雌激素類和氯霉素類藥物分離，具有較好的靈敏度和分辨率。

2.1.3 梯度洗脫條件的選擇

由于10種雌激素類和氯霉素類的極性差異較大，采用恒定的流動相很難將各個藥物分開，故采用梯度洗脫的方式，改變流動相的極性，從而達到使目標藥物完全分開的目的。實驗比較了不同比例的初始流動相中的有機相（5%，10%，20%）和不同的洗脫時間（12，15，20 min）對洗脫效果的影響。隨著乙腈比例的升高，多數藥物被快速的洗脫下來，沒有達到良好的分離，當乙腈的初始比例為5%時，目標藥物能被緩慢地洗脫下來，分離良好。隨著洗脫時間的增加，全部藥物能有較好的靈敏度和分辨率。故選擇初始流動相有機相比例為5%，洗脫時間20 min。

2.1.4 定容液的選擇

表1 10種雌激素類和氯霉素類藥物信息

樣品定容液不僅會影響目標藥物的分離效果，而且還會影響離子化效率。本實驗比較了超純水、乙腈-水（5∶95，體積比）、乙腈-水（20∶80，體積比）、乙腈-水（50∶50，體積比）和乙腈-水（90∶10，體積比）作為定容液時的情況，實驗發(fā)現(xiàn)，當定容液有機相比例超過初始流動相中的有機相比例時，多數藥物的峰形變寬。當有機相比例不大于初始流動相時，峰形較尖銳，本實驗選擇乙腈-水（5∶95，體積比）作為定容液，跟初始流動相比例相同。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

Dual AJS ESI容負離子模式下，在50～1 000 m/z范圍內作一級質譜全掃描，得到10種雌激素類和氯霉素類藥物的總離子色譜圖。比較各個化合物的提取離子色譜圖的響應和峰形，依次優(yōu)化鞘氣溫度和流速、噴嘴電壓、毛細管電壓、霧化器壓力和干燥氣溫度和流速。然后優(yōu)化不同的碎裂電壓，在定性分析軟件中，選擇最優(yōu)電壓參數。詳細參數見1.5.2。

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1 超濾膜方法的優(yōu)化

稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩30 s，轉速為8 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液于40℃氮氣吹至近干，用1.0 mL乙腈-水溶液（5∶95，體積比）定容，轉移至3 ku的超濾離心管中，14 000 r/min離心60 min，凈化過后的提取液用于進樣分析。實驗比較了未經初始流動相溶液潤洗超濾膜（A組）和經初始流動相溶液潤洗（B組）對超濾離心管凈化效果的影響。實驗結果如圖1所示，預洗步驟對目標藥物的回收率沒有產生明顯影響。另外，雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的回收率均低于50%。

圖1 預洗對10種雌激素類和氯霉素類藥物回收率的影響

2.3.2 QuEChERS提取溶劑的優(yōu)化

為了同時提取10種雌激素類和氯霉素類藥物，實驗比較了不同酸度的乙腈作為提取液，分別為：乙腈（A）、0.1%甲酸乙腈（B）、1%甲酸乙腈（C）、0.1%乙酸乙腈（D）、1%乙酸乙腈（E）。10種雌激素類和氯霉素類藥物的回收率實驗結果如圖2所示。由圖2可以看出：B，C，D，E組的雙烯雌酚和己烷雌酚回收率不足20%；C，D，E組的己烯雌酚已檢測不出；A組藥物總體回收率介于50%～120%之間，故選擇A組（乙腈）作為提取溶劑。

2.3.3 QuEChERS凈化步驟的優(yōu)化

傳統(tǒng)的QuEChERS方法使用PSA作為吸附劑去除果蔬中脂肪酸色素等物質，而牛乳基質更為復雜，含有大量的脂肪和蛋白，脂肪和蛋白質的干擾對牛乳樣品至關重要。PSA是在高純硅膠基質上鍵合N-丙基乙二胺的極性吸附劑。C18是一種非極性吸附劑，可吸附非極性到中等級性的化合物。PSA和C18都可用于除去脂肪酸、色素和糖類等基質成分，這些分散固相萃取劑在凈化樣品的同時有可能對目標產物產生一定的吸附作用，因此有必要對PSA（A組）和C18（B組）進行優(yōu)化。以藥物的回收率作為評定依據，實驗結果如圖3所示，由圖3可以看出：B組己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚回收率不足30%，與B組數據相比，A組數據回收率介于50%～120%之間，故優(yōu)化條件選擇A組（PSA）作為吸附劑。

2.3.4 超濾膜與QuEChERS方法的比較

從圖1和圖3可以發(fā)現(xiàn)，超濾膜雖然能夠節(jié)省時間，簡化步驟，但是有超過50%的藥物回收率低于50%。QuEChERS方法藥物回收率介于50%和120%之間，適用于藥物多殘留分析，故采用QuEChERS方法。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線與線性范圍

圖2 提取溶劑對10種雌激素類和氯霉素類藥物回收率的影響

圖3 優(yōu)化實驗條件的回收率實驗結果

采用液相色譜-串聯(lián)質譜方法的弊端之一是基質效應現(xiàn)象，因此有必要對基質效應進行考察。取空白生鮮牛乳樣品基質溶液與流動相分別配制標準溶液，以分子離子峰面積Y對質量濃度X（μg·L-1）作標準曲線，獲得目標化合物的基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線。利用公式ME=k1/k2×100%計算基質效應（見表2）。其中k1和k2分別為基質匹配標準曲線的斜率和溶劑標準曲線的斜率。ME偏離100%越多，說明基質效應越明顯。如表2所示，氟苯尼考和雌三醇出現(xiàn)了

基質增強效應，己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚出現(xiàn)較強的基質抑制，其余的化合物基質效應不明顯。因此本實驗采用基質匹配標準曲線外標法定量。10種雌激素類和氯霉素類的線性方程、線性范圍和相關系數如表2所示。

2.4.2 檢出限（LOD）與定量限（LOQ）

用空白牛乳基質提取液稀釋標準曲線的最低濃度，以3倍儀器檢測信噪比（S/N=3）計算各化合物的定性篩查檢出限（LOD），結果表明，10種雌激素類和氯霉素類的LOD為5～20 μg/kg。以10倍信噪比（S/N=10）估算定量下限，10種雌激素類和氯霉素類的LOQ為10～50 μg/kg。實驗結果如表2所示。

2.4.3 回收率與精密度

采用空白生鮮牛乳樣品進行加標回收率及精密度實驗，樣品分別添加低、中、高3個質量濃度的標準溶液，每個濃度平行測定6次，計算平均回收率及相對標準偏差（RSD），測定結果如表3所示。由表3可以看出，10種雌激素類和氯霉素藥物的回收率為61.2%～116.3%，相對標準偏差為2.3%～10.8%。

2.5 實際樣品的篩查

應用本方法對全國8個省市的80份牛乳樣品，采用已建立的超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜篩查方法，再經二級質譜確證，結果發(fā)現(xiàn)：雌酮和雌三醇均表現(xiàn)出一定的個體差異性，雌酮的平均值為132.0 μg/kg，最大值達到了393.9 μg/kg。雌三醇的均值質量分數為52.0 μg/kg，最大值達到了92.5 μg/kg。

表2 10種雌激素類和氯霉素類藥物的實驗結果的基質效應、線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

表3 10種雌激素類和氯霉素類藥物的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

雌三醇、雌酮為天然激素，可能為奶牛體內的內源性激素。作為一種篩查方法，適用于生鮮牛乳中雌激素類和氯霉素類藥物的快速定性確證，可為監(jiān)管和監(jiān)督提供技術依據。

3 結論

利用超高效液相色譜的快速分析與飛行時間質譜的高分辨率優(yōu)勢，建立了生鮮牛乳中10種雌激素類和氯霉素類藥物的超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜篩查與確證方法，改進了前處理方法，優(yōu)化了色譜質譜條件。本方法快速簡便，前處理成本低廉。作為一種篩查方法，適用于生鮮牛乳中10種雌激素類和氯霉素類藥物的快速定性確證。