何智超 林楠 尹丕發(fā)

[摘要] 目的 研究Th17/Treg細(xì)胞失衡與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者疾病活動(dòng)度及炎癥程度的關(guān)系。 方法 選擇從2017年1月～2018年5月在云南省老年病醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診治的UC患者93例進(jìn)行研究，UC活動(dòng)期者56例為活動(dòng)期組，UC緩解期者37例為緩解期組。根據(jù)改良Mayo評(píng)分將活動(dòng)期組劃分亞組：輕度組19例、中度組24例、重度組13例。另選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的40名志愿者作為對(duì)照組。檢測(cè)并比較各組Th17/Treg、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素（IL）-10及IL-17水平，分析患者Th17、Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)度及炎癥程度的關(guān)系。 結(jié)果 活動(dòng)期組及緩解期組的Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg水平較對(duì)照組高，且活動(dòng)期組較緩解期組高（P < 0.05），活動(dòng)期組的Treg細(xì)胞比例較對(duì)照組低（P < 0.05）。重度組的Th17/Treg水平較輕度組和中度組高，且Th17細(xì)胞比例較輕度組高（P < 0.05），Treg細(xì)胞比例較輕度組和中度組低（P < 0.05）?；顒?dòng)期組及緩解期組的CRP及IL-17水平較對(duì)照組高，且活動(dòng)期組較緩解期組高（P < 0.05）?；顒?dòng)期組及緩解期組的IL-10水平較對(duì)照組低（P < 0.05）。重度組的CRP及IL-17水平較輕度組高，IL-10水平較輕度組低（P < 0.05），重度組的CRP水平較中度組高，且中度組較輕度組高（P < 0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果，Th17細(xì)胞及Th17/Treg與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈正相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 UC患者機(jī)體中Th17/Treg細(xì)胞失衡與其疾病活動(dòng)度及炎癥程度之間存在密切關(guān)系，臨床上應(yīng)盡可能地確?；颊叩腡h17/Treg細(xì)胞平衡，從而有利于其病情防控。

[關(guān)鍵詞] Th17/Treg細(xì)胞失衡;潰瘍性結(jié)腸炎;疾病活動(dòng)度;炎癥程度;關(guān)系

[中圖分類號(hào)] R574.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（b）-0130-04

[Abstract] Objective To study the relationship between the imbalance of Th17/Treg cells and the degree of disease activity and inflammation in patients with ulcerative colitis （UC）. Methods Ninety-three patients with UC from January 2017 to May 2018 admitted to Yunnan Geriatric Hospital （“our hospital” for short） were selected and studied. Among the patients， 56 cases in UC active period were as the active period group， 37 cases in remission period were as the remission period group. The active stage group was divided into subgroups according to the modified Mayo scoring： 19 cases in the mild group， 24 cases in the moderate group， and 13 cases in the severe group. Another 40 healthy volunteers undergoing physical examination in the same period were selected as the control group. The levels of Th17/Treg， C-reactive protein （CRP）， interleukin （IL）-10， IL-17 were detected and compared. Th17， Treg cells in each group were measured and the relationship between Th17， Treg cells and disease activity and inflammation was analyzed. Results The proportion of Th17 cells and the level of Th17/Treg in the active period group and the remission period group were significantly higher than the control group， and those in the active period group were significantly higher than the remission period group （P < 0.05）， and the proportion of Treg cells in the active period group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. Th17/Treg level in the severe group was significantly higher than the mild group and moderate group， and the proportion of Th17 cells was significantly higher than the mild group （P < 0.05）. The proportion of Treg cells in the severe group was significantly lower than the mild group and moderate group （P < 0.05）. The CRP and IL-17 in the active period group and the remission period group were significantly higher than the control group， and the CRP and IL-17 in the active period group were significantly higher than the remission period group （P < 0.05）. The IL-10 in active period group and remission period group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. The CRP and IL-17 in the severe group were significantly higher than the mild group （P < 0.05）. The CRP in the severe group was significantly higher than the mild group， and the CRP in the severe group was significantly higher than the mild group （P < 0.05）. According to Pearson correlation analysis method， the Th17 cells and Th17/Treg were positively correlated with disease activity and IL-17， and was negatively correlated with IL-10 （P < 0.05）. The Treg cells was negatively correlated with disease activity， CRP， IL-17 and positively correlated with IL-10 （P < 0.05）. Conclusion There is a close relationship between the imbalance of Th17/Treg cells and the degree of disease activity and inflammation in the patients with UC. The balance of Th17/Treg cells in patients with UC should be ensured as much as possible in clinic， which is beneficial to the prevention and control of the disease.

[Key words] Imbalance of Th17/Treg cells; Ulcerative colitis; Disease activity; Degree of inflammation; Relationship

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）作為慢性遷延性的腸道炎性疾病，具有較高的復(fù)發(fā)性，患者的病灶大都局限在黏膜及黏膜下層區(qū)域，可累及直腸和乙狀結(jié)腸，造成腹瀉和黏液膿血便等癥狀，使患者產(chǎn)生較大的痛苦[1]。目前對(duì)于UC的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，臨床認(rèn)為可能和免疫、感染及遺傳等諸多因素有關(guān)，其中免疫致病因素得到了較為廣泛的認(rèn)可[2]。有報(bào)道指出，免疫細(xì)胞和UC的病情進(jìn)展有一定關(guān)系，Th17細(xì)胞可通過分泌白細(xì)胞介素（IL）-17誘導(dǎo)腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)，而Treg細(xì)胞的減少可能與UC發(fā)病有關(guān)，但相關(guān)研究并未作深入分析[3-4]。本研究通過探討Th17/Treg細(xì)胞失衡與UC疾病活動(dòng)度以及炎癥程度之間的關(guān)系，旨在為臨床疾病的診治及防控提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月～2018年5月在云南省老年病醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診治的UC患者93例進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見》[5]中關(guān)于UC的診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≥18歲;③患者均對(duì)本研究知情同意，并簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因腸道致病菌、真菌及結(jié)核分枝桿菌以及病毒等病原體引起的腸道感染者;②有其他免疫類疾病及感染性疾病者;③有血液疾病或惡性腫瘤者;④有心、肝、腎等臟器功能嚴(yán)重障礙者;⑤妊娠期或哺乳期婦女。93例患者中，處于活動(dòng)期者56例，記為活動(dòng)期組，根據(jù)改良Mayo評(píng)分劃分亞組：輕度組（3～5分）19例，中度組（6～10分）24例，重度組（11～12分）13例;緩解期者37例，記為緩解期組，另選同期在我院進(jìn)行健康體檢的40名志愿者作為對(duì)照組。各組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性，見表1。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核及批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器和試劑? （1）美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Calibur流式細(xì)胞儀。（2）美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀。（3）美國(guó)eBioscience公司生產(chǎn)的以下試劑：①抗人CD4-FITC;②CD25-APC;③Foxp3-PE;④CD3-APC;⑤CD8a-FITC;⑥IL-17A-PE抗體;⑦刺激阻斷劑;⑧固定破膜液。（4）C反應(yīng)蛋白（CRP）、IL-17及IL-10的ELISA試劑盒購(gòu)自深圳的晶美生物工程公司（批號(hào)：20161101）。

1.2.2 Th17細(xì)胞檢測(cè)? 為各組受試者采集其在空腹?fàn)顟B(tài)下250 μL經(jīng)肝素鈉抗凝的全血，添加250 μL 150 g/L胎牛血清型BPMI 1640及1 μL的刺激阻斷劑進(jìn)行細(xì)胞重懸，置于5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)約4 h。再取刺激后約100 μL的抗人CD8a-FITC和CD3-APC在4℃條件下行25 min的避光孵育，依次添加MEDIUM A、B液，在室溫下孵育約15 min，給予2次PBS液沖洗，再將抗人IL-17A-PE抗體在4℃條件下行25 min的避光孵育，給予PBS液沖洗后重懸待測(cè)。

1.2.3 Treg細(xì)胞檢測(cè)? 為各組受試者采集其在空腹?fàn)顟B(tài)下100 μL經(jīng)肝素鈉抗凝的全血，加入標(biāo)記抗人CD4-FITC及CD25-APC在4℃條件下行25 min的避光孵育，再加進(jìn)紅細(xì)胞裂解液，在室溫下放置10 min，以PBS液沖洗2次，再加入固定破膜液于4℃下避光放置1 h，給予2次PBS液沖洗，抗人Foxp3-PE在4℃條件下避光孵育約25 min，給予2次PBS液沖洗，通過流式細(xì)胞儀和Flowjo7.6軟件實(shí)施檢測(cè)分析。

1.2.4 CRP、IL-10及IL-17檢測(cè)? 為各組受試者采集其在空腹?fàn)顟B(tài)下4 mL外周血，以12 cm的離心半徑給予10 min、3000 r/min的離心之后提取上清液，通過酶聯(lián)免疫法及相關(guān)試劑盒內(nèi)的說明書描述步驟進(jìn)行操作，記錄酶標(biāo)儀下OD450讀數(shù)，并將OD值作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終記錄CRP、IL-10及IL-17水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較選采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Th17、Treg細(xì)胞比例比較

活動(dòng)期組及緩解期組的Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg水平較對(duì)照組高，且活動(dòng)期組較緩解期組高，活動(dòng)期組的Treg細(xì)胞比例較對(duì)照組低（P < 0.05）。重度組的Th17/Treg水平較輕度組和中度組高，且Th17細(xì)胞比例較輕度組高，Treg細(xì)胞比例較輕度組和中度組低（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組CRP、IL-10及IL-17水平比較

活動(dòng)期組及緩解期組的CRP及IL-17水平較對(duì)照組高，且活動(dòng)期組較緩解期組高（P < 0.05）?；顒?dòng)期組及緩解期組的IL-10水平較對(duì)照組低（P < 0.05）。重度組的CRP及IL-17水平較輕度組高，IL-10水平較輕度組低，重度組的CRP水平較中度組高，且中度組CRP水平較輕度組高（P < 0.05）。見表2。

2.3 Th17、Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)度及炎癥程度的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示，Th17細(xì)胞及Th17/Treg與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈正相關(guān)（P < 0.05）。見表3。

3 討論

UC屬于一種慢性非特異型炎癥類疾病，患者通常會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、黏液膿血便和里急后重等腸道癥狀，病灶區(qū)主要分布在大腸黏膜和黏膜下層，具有連續(xù)性及彌漫性特質(zhì)，并可反復(fù)發(fā)作，對(duì)患者日常工作及生活具有較大危害[6-7]。以往此病在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病率較高，但近年來的臨床資料數(shù)據(jù)顯示，UC在我國(guó)的發(fā)病率也出現(xiàn)了逐漸升高的趨勢(shì)[8-9]。

目前，關(guān)于UC的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但相關(guān)報(bào)道顯示其可能與機(jī)體的免疫異常等因素有關(guān)[10-11]。由于Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞在機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用，分析二者失衡與UC患者疾病活動(dòng)度及炎癥程度的關(guān)系十分必要。

Th17細(xì)胞屬于輔助型T細(xì)胞，Treg細(xì)胞對(duì)機(jī)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)過程具有較為明顯的調(diào)節(jié)作用，二者能較好地反映機(jī)體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)。本研究顯示，UC患者存在一定程度的Th17/Treg細(xì)胞失衡，這種失衡狀態(tài)與疾病活動(dòng)度有關(guān)，Th17細(xì)胞主要是通過原始的CD4+T細(xì)胞于IL-6及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1等物質(zhì)的刺激下不斷分化形成的一類輔助型T細(xì)胞，其可通過強(qiáng)化細(xì)胞通透性、加速炎癥細(xì)胞的募集和活化，進(jìn)而使UC患者的機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)炎性變化[12-13]。Treg細(xì)胞屬于一種T細(xì)胞亞群，具有免疫調(diào)節(jié)作用正常情況下，其可使得免疫系統(tǒng)能夠耐受自身成分，并使機(jī)體處于免疫穩(wěn)態(tài)。在UC患者機(jī)體中，Treg細(xì)胞可發(fā)揮免疫抑制作用，其不僅能殺傷機(jī)體中的CD4+、CD8+T細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞，而且可分泌出IL-10等細(xì)胞因子以及有細(xì)胞毒性的T細(xì)胞有關(guān)抗原4等物質(zhì)而達(dá)到抑制免疫的作用[14-16]。同時(shí)，CRP、IL-17及IL-10均屬于炎性細(xì)胞因子，三者對(duì)機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)具有較好的指示性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，UC患者機(jī)體中的CRP、IL-17水平有升高趨勢(shì)，但I(xiàn)L-10水平有下降趨勢(shì)，且三者指標(biāo)的變化與病情有較大聯(lián)系。UC患者機(jī)體內(nèi)炎癥狀態(tài)較為明顯，導(dǎo)致CRP這一敏感的炎癥指標(biāo)水平不斷上升。Th17細(xì)胞所分泌出的IL-17屬于誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其可參與到炎癥的形成及宿主對(duì)細(xì)菌感染的防御過程，能夠引起組織浸潤(rùn)及損傷[17-18]。適應(yīng)性調(diào)節(jié)型T細(xì)胞所分泌的IL-10可降低機(jī)體中的炎性細(xì)胞因子水平，并對(duì)由T細(xì)胞所介導(dǎo)的有關(guān)免疫反應(yīng)發(fā)揮抑制作用。本研究進(jìn)一步根據(jù)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及Th17/Treg與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)度、CRP及IL-17均呈負(fù)相關(guān)，與IL-10呈正相關(guān)（P < 0.05），提示UC患者機(jī)體中的Th17/Treg細(xì)胞失衡與其疾病活動(dòng)度以及炎癥程度具有明顯的關(guān)聯(lián)性。分析原因主要是因?yàn)門reg細(xì)胞減少能夠促使CD4+T細(xì)胞朝Th17細(xì)胞不斷分化，致使Th17細(xì)胞比例上升、功能亢進(jìn)，強(qiáng)化了炎性細(xì)胞因子等分泌，最終產(chǎn)生炎性反應(yīng)[19-20]。而Th17細(xì)胞增多后又可提升IL-17水平，但Treg細(xì)胞減少后又可降低IL-10水平，同時(shí)自身反應(yīng)型T細(xì)胞逐漸被激活，而抑制性免疫細(xì)胞因子減少，此種變化又會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜炎癥加重。因此，無論是Th17細(xì)胞增多，或是Treg細(xì)胞減少，臨床上均應(yīng)確保Th17/Treg細(xì)胞平衡，可較好地預(yù)防UC發(fā)作。

綜上所述，UC患者機(jī)體中Th17/Treg細(xì)胞失衡與其疾病活動(dòng)度及炎癥程度之間存在密切相關(guān)性，臨床上應(yīng)盡可能地維持患者Th17/Treg細(xì)胞平衡，從而有利于病情防控。

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（收稿日期：2018-09-25? 本文編輯：金? ?虹）