申旺 楊文麗 葉麗燕 譚曉宇 黃晨娟 張?chǎng)?/p>

(1.暨南大學(xué)附屬五邑中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江門 529000；2.江門市中心醫(yī)院病理科，江門 529030)

【關(guān)健詞】 G試驗(yàn)；念珠菌；曲霉菌；侵襲；診斷

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代治療手段的大量開(kāi)展，廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，腫瘤、血液病、糖尿病等發(fā)病率不斷上升，導(dǎo)致侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)逐年上升，其中又以侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)為主，約占60%～80%[1-2]。IFD診斷的主要方法是組織真菌培養(yǎng)和鏡檢，但其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，常延誤患者的診斷和治療，是造成IFD患者高死亡率的原因之一[3]。近年來(lái)，(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn))成為深部真菌病研究的熱點(diǎn)，其在IFD診斷中的價(jià)值已得到國(guó)內(nèi)、外研究的認(rèn)可[2-4]。曲霉菌是除念珠菌外，引起IFD的第二大致病菌，但少見(jiàn)G試驗(yàn)在IC和侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)間的比較研究，同時(shí)也缺乏G試驗(yàn)在不同IC患者中的診斷價(jià)值差異性研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同人群G試驗(yàn)水平的比較，探討其在IC患者診斷中的臨床價(jià)值及與患者粒細(xì)胞、病原菌、體溫之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年9月至2018年6月期間在暨南大學(xué)附屬五邑中醫(yī)院住院治療的侵襲性念珠菌病(IC)患者55例(同時(shí)伴有發(fā)熱≥37.5℃)、侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)患者42例(均為肺部或支氣管曲霉病)，兩組患者均符合《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(第四次修訂版)》[5]中的深部真菌病確診組和臨床診斷組的診斷指標(biāo)；同時(shí)收集念珠菌黏膜定植組者30例(排除真菌感染，僅痰或中段尿中培養(yǎng)出念珠菌)和健康體檢者50名。以上各組研究對(duì)象在性別和年齡上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)排除近期有輸注白蛋白、免疫球蛋白、抗腫瘤的多糖類等藥物及近1個(gè)月內(nèi)有過(guò)血液透析治療的患者。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司生產(chǎn)的(1,3)-β-D-葡聚糖試劑，德國(guó)ELx808IU酶標(biāo)儀，沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基，凱林念珠菌屬真菌顯色培養(yǎng)基，上海躍進(jìn)SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，法國(guó)梅里埃BacT/AlerT3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及其配套的血培養(yǎng)瓶，法國(guó)梅里埃API-20C AUX酵母菌鑒定板和ATB Expression半自動(dòng)微生物鑒定儀。

1.3 G試驗(yàn)操作和真菌培養(yǎng)鑒定

IC 組和IA組患者于使用抗真菌藥物治療前連續(xù)2天抽取2次血液進(jìn)行 G 試驗(yàn)檢測(cè),操作過(guò)程嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,反應(yīng)管和吸嘴均去除熱原,若兩次均為陽(yáng)性,則以第1次結(jié)果為準(zhǔn),若2次結(jié)果不相符,則重新抽取標(biāo)本,以第3次檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。念珠菌黏膜定植組患者和健康人群于清晨空腹采集靜脈血1次進(jìn)行G試驗(yàn)。以G試驗(yàn)水平≥10 pg/mL為結(jié)果陽(yáng)性。

在患者使用抗真菌藥物前，采用無(wú)菌方法采集患者的可疑感染標(biāo)本比如血液、膿液、胸腹水、引流液等，接種血培養(yǎng)瓶或血平板，若有細(xì)菌生長(zhǎng)，涂片鏡檢確認(rèn)為真菌后，再接種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基和真菌顯色培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d，若無(wú)菌落生長(zhǎng)則為培養(yǎng)陰性；若有翠綠色菌落生長(zhǎng)則為白念珠菌；藍(lán)灰色則為熱帶念珠菌；粉色為光滑念珠菌；淡粉色和紫色為克柔念珠菌；白色為其他念珠菌，同時(shí)結(jié)合API-20C AUX酵母菌鑒定板鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS19.0軟件對(duì)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量單位采用四分位數(shù)M(P25，P75)描述，診斷價(jià)值采用受試者工作曲線(ROC)分析，組間比較采用軼和檢驗(yàn)，率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者的G試驗(yàn)水平

IC組患者的G試驗(yàn)濃度為73.56(26.80,157.90) pg/mL，與健康正常組、念珠菌黏膜定植組、IA組感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 IC患者念珠菌菌種的分布

55例IC患者中，有23例患者培養(yǎng)出白念珠菌，占比為41.82%，低于非白念珠菌58.18%(32/55)。32例非白念珠菌的病原菌包括熱帶念珠菌12例(21.82%)，光滑念珠菌10例(18.18%)，克柔念珠菌4例(7.27%)，近平滑念珠菌3例(5.45%)，季也蒙念珠菌、角膜念珠菌和葡萄牙念珠菌各1例(1.82%)。

2.3 G試驗(yàn)在IC中的診斷價(jià)值

分別以非IFD組(健康正常組和念珠菌定植組)和非IC組(健康正常組、念珠菌定植組和IA組)作為對(duì)照組，做G試驗(yàn)診斷IC組患者的受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)，發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)在IC患者中均有較高的診斷價(jià)值(AUC分別為0.899、0.782)，見(jiàn)表2。

2.4 G試驗(yàn)在不同IC患者中的陽(yáng)性率差異分析

以ROC曲線AUC最大的臨界點(diǎn)G試驗(yàn)19.05 pg/mL為判斷標(biāo)準(zhǔn)，55例IC患者中有43例G試驗(yàn)為陽(yáng)性，根據(jù)IC患者的中性粒細(xì)胞數(shù)量、體溫高低、病原菌類型進(jìn)行分組。G試驗(yàn)在中性粒細(xì)胞正常組中陽(yáng)性率最高為93.10%，與增高組和減少組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與粒細(xì)胞缺乏組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；G試驗(yàn)在白念珠菌感染組中的陽(yáng)性率最高為86.96%，與熱帶和光滑念珠菌感染組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.699)，但顯著高于其他念珠菌感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；G試驗(yàn)在中熱組中的陽(yáng)性率最高為82.86%，但與高熱組和低熱組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 各組G試驗(yàn)濃度分析

表2 G試驗(yàn)診斷IC患者的ROC分析

表3 G試驗(yàn)陽(yáng)性率與IC患者白細(xì)胞、體溫、病原菌之間的關(guān)系

3 討 論

念珠菌是一種在自然界廣泛存在并可寄生于人體的最常見(jiàn)真菌。正常條件下，念珠菌只寄生于人體皮膚、口腔、陰道、黏膜等處，不會(huì)導(dǎo)致深部真菌感染，當(dāng)人體免疫功能低下、生理屏障喪失、菌種失調(diào)時(shí)，念珠菌可侵入人體組織、器官、血液，導(dǎo)致侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)[6]。由于念珠菌是條件致病菌，IC臨床癥狀缺乏特異性，易被原發(fā)疾病或并發(fā)癥所掩蓋，故極易被誤診、漏診。真菌培養(yǎng)是臨床最常見(jiàn)的IC診斷方法，不僅可明確病原菌，還可為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，但真菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)受標(biāo)本采集不規(guī)范、運(yùn)送過(guò)程或接種時(shí)易被污染等影響，尤其無(wú)法將致病菌和定植菌、污染菌有效區(qū)分[7]，故會(huì)影響臨床醫(yī)生的診斷，從而延誤治療，這也是導(dǎo)致IC患者高死亡率的原因之一。

(1,3)-β-D-葡聚糖是一種多糖，存在于除隱球菌和接合菌外的所有真菌細(xì)胞壁中，當(dāng)念珠菌侵入人體組織或血液時(shí)，可被粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬或消化，從而破壞其細(xì)胞壁，使(1,3)-β-D-葡聚糖大量釋放到血液或體液中，導(dǎo)致(1,3)-β-D-葡聚糖水平升高。當(dāng)念珠菌定植時(shí)，機(jī)體未發(fā)生炎癥反應(yīng)，念珠菌不會(huì)被吞噬，故(1,3)-β-D-葡聚糖也不會(huì)釋放出來(lái)。因(1,3)-β-D-葡聚糖能與馬蹄蟹中的一種G凝血因子結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，可根據(jù)其濁度的變化程度進(jìn)行定量檢測(cè)，故(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)又稱為G試驗(yàn)[8]。

本研究中，IC組患者的G試驗(yàn)濃度顯著高于健康正常組和念珠菌黏膜定植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明G試驗(yàn)不僅能判斷IC感染的發(fā)生，還能有效區(qū)分其為致病菌還是定植菌。研究也發(fā)現(xiàn)IC組G試驗(yàn)濃度顯著高于IA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明G試驗(yàn)可能對(duì)致病真菌是念珠菌還是曲霉菌也有一定的鑒別價(jià)值，這可能一方面與念珠菌細(xì)胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖含量比曲霉菌更高有關(guān)，另一方面也與研究診斷標(biāo)準(zhǔn)的差異性有關(guān)，本研究以在患者支氣管肺泡灌洗液中鏡檢有尖銳分支的、分隔的菌絲即為IA的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

以往認(rèn)為白念珠菌是IC感染的主要致病菌，但在本研究的55例IC患者中，非白念珠菌感染患者32例，多于白念珠菌的23例，其中非白念珠菌又以熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主(40.00%)，其次為克柔念珠菌和近平滑念珠菌(12.73%)，與秦曉峰等[9]研究略有不符，但和中國(guó)侵襲性真菌檢測(cè)網(wǎng)CHIF-NET的數(shù)據(jù)[10]基本一致。這表明非白念珠菌已超越白念珠菌成為院內(nèi)念珠菌感染的主要菌種，這可能與唑類抗真菌藥物的大量使用有關(guān)[11]。臨床醫(yī)生常用唑類抗真菌藥物預(yù)防真菌感染的發(fā)生，白念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥物有較高的敏感性，克柔念珠菌和近平滑念珠菌也比較敏感，但光滑念珠菌和熱帶念珠菌對(duì)唑類藥相對(duì)耐藥。

本研究分別以健康正常組、念珠菌黏膜定植組和以健康正常組、念珠菌黏膜定植組、IA組作為對(duì)照，采用ROC曲線分析G試驗(yàn)在IC患者中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)不僅對(duì)IC具有較高的診斷價(jià)值(AUC分別為0.899,0.782)，還能有效區(qū)分IC和IA感染。這可能與兩者感染部位有關(guān)，IC常以念珠血癥和播散性念珠菌病為主，易侵入血液，而IA主要感染患者的支氣管-肺組織。支氣管和肺組織內(nèi)含有大量氣道黏膜分泌的糖蛋白、脂質(zhì)、蛋白聚糖等成分，一方面可將曲霉包裹起來(lái)防止被吞噬細(xì)胞吞噬或消化；另一方面即使被巨噬細(xì)胞清除，其釋放的(1,3)-β-D-葡聚糖也往往局限于呼吸道，較少出現(xiàn)在血中，只有當(dāng)曲霉生長(zhǎng)并伴血管侵犯時(shí)，才會(huì)釋放入血[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)在IC中的陽(yáng)性率與患者中性粒細(xì)胞含量和念珠菌的種類有關(guān)，與體溫?zé)o關(guān)。G試驗(yàn)在中性粒細(xì)胞正常組的陽(yáng)性率最高(93.10%)，與中性粒細(xì)胞增高組和減少組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但顯著高于中性粒細(xì)胞缺乏組(28.57%)，這提醒對(duì)于粒細(xì)胞缺乏的患者，G試驗(yàn)可能存在較高的假陰性。粒細(xì)胞缺乏常見(jiàn)于腫瘤放化療、骨髓抑制、免疫缺陷等患者，同時(shí)這些也是念珠菌感染的高危因素，但粒細(xì)胞缺乏同時(shí)可造成免疫應(yīng)答減弱，導(dǎo)致被粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬的念珠菌減少，釋放的(1,3)-β-D-葡聚糖也相應(yīng)降低，使得患者G試驗(yàn)濃度未達(dá)到陽(yáng)性臨界線[13]。本研究中的2例粒細(xì)胞缺乏G試驗(yàn)陽(yáng)性的IC患者均是腫瘤連續(xù)化療后導(dǎo)致的，未存在吞噬細(xì)胞功能缺陷，其病原菌也均是白念珠菌。本研究也從病原菌角度對(duì)G試驗(yàn)陽(yáng)性率進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)白念珠菌IC組患者的G實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率高于其他兩組，這可能與白念珠菌定植分布廣泛以及其獨(dú)特的入侵機(jī)制有關(guān)，一方面白念珠菌被吞噬細(xì)胞吞噬后，仍能繁殖如生成芽管并長(zhǎng)出菌絲，另一方面在包括樹(shù)突細(xì)胞、粒細(xì)胞在內(nèi)的所有髓系細(xì)胞和上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞等B細(xì)胞中均有C型凝集素受體(Dectin-1)的表達(dá)，Dectin-1受體的主要作用是識(shí)別白念珠菌的(1,3)-β-D-葡聚糖[14]，從而充分激活宿主細(xì)胞對(duì)白念珠菌的免疫應(yīng)答，使白念珠菌大量被吞噬消化，促使(1,3)-β-D-葡聚糖釋放。有文獻(xiàn)[15]指出G試驗(yàn)在近平滑念珠菌深部感染時(shí)陽(yáng)性率偏低，由于本實(shí)驗(yàn)中近平滑念珠菌例數(shù)較少，未對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)分析，以后將多收集標(biāo)本例數(shù)，進(jìn)一步研究證實(shí)。發(fā)熱是人體對(duì)病原菌入侵產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)從而產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象，理論上體溫升高可加快免疫應(yīng)答反應(yīng)，如加速白細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原菌的能力等等。但本研究發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)陽(yáng)性率與IC患者體溫相差不大，這可能與發(fā)熱患者使用抗生素等降溫藥有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，G試驗(yàn)對(duì)IC具有較高的診斷價(jià)值，不僅能有效區(qū)分致病菌和定植菌，還對(duì)念珠菌感染和曲霉菌感染有一定的鑒別作用。G試驗(yàn)的陽(yáng)性率與IC患者的體溫?zé)o關(guān)，與中性粒細(xì)胞數(shù)量和病原菌類型存在一定的關(guān)系，尤其在粒細(xì)胞缺乏IC患者和除白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌外的其他念珠菌感染的IC患者中的陽(yáng)性率偏低。