鄭慧，鄭淘，王睿捷，唐錦瑤，紹欣欣，李順祥

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,食品藥品工程系,湖南 長(zhǎng)沙，410208) 2(湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙，410208)

蜂花粉是蜜蜂采集植物花蕊中的花粉，添加花蜜及其分泌物混合而成的不規(guī)則團(tuán)狀物，顆粒直徑介于2.0～3.5 mm，具有良好的增強(qiáng)免疫力、抑制脂褐素、抗氧化、抗腫瘤等功效[1-3]。在中國(guó)，油菜花粉、玉米花粉、蕎麥花粉等蜂花粉被原衛(wèi)生部2014年17號(hào)公告納入“作為普通食品管理的食品新資源名單”，產(chǎn)品生產(chǎn)、管理、研發(fā)門檻相對(duì)較低。近年來(lái)蜂花粉研發(fā)熱度日益升溫，其中因其多酚類組分含量豐富，具有較強(qiáng)的抗氧化性，已成為蜂花粉的特征性功效成分[4-5]。

蜂花粉細(xì)胞外壁質(zhì)地堅(jiān)硬，具有抗?jié)B透、抗酸堿、抗生物分解性能；但同時(shí)又存在萌發(fā)孔和萌發(fā)溝，可通過此與外界進(jìn)行物質(zhì)交換。有研究表明破壁后蜂花粉抗氧化、免疫、降血脂等功效增強(qiáng)；另一方面又有研究表明在胃腸消化過程中，蜂花粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過萌發(fā)孔和萌發(fā)溝滲透出而被吸收，破壁反而不利于花粉的保存，故至今蜂花粉破壁與否對(duì)其保健功能、質(zhì)量控制等方面的影響還存在不同觀點(diǎn)[6-8]。因蜂花粉本身呈顆粒狀，很多時(shí)候須將其進(jìn)行粉碎、甚至破壁處理以便后續(xù)加工[9-10]，為探究粉碎粒徑對(duì)蜂花粉多酚在人體胃腸道消化吸收特性的影響，本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬方式，對(duì)比4種粉碎粒徑的油菜蜂花粉其多酚溶出情況以及被腸道菌群利用發(fā)酵產(chǎn)酸特性，為蜂花粉深加工及其產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干油菜蜂花粉，2017年產(chǎn)自湖南；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽，上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純)，默克化工技術(shù)上海有限公司；乙酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；丙酸、丁酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；原兒茶酸、福林酚、FeSO4·7H2O、CaCl2·6H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2、CuSO4·5H2O等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XQM-2球磨機(jī)，湖南長(zhǎng)沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司；LS-POP激光粒度儀，珠海歐美克儀器有限公司；EVO 18掃描電子顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；ZHWY-200D恒溫振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；AV1120電子分析天平，日本島津儀器有限公司；UV 1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；DW-40W390低溫保存箱，澳柯瑪股份有限公司；STARTER 3100/F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將蜂花粉原料置于普通粉碎機(jī)、XQM-2球磨機(jī)中分別處理一定時(shí)間，經(jīng)篩網(wǎng)篩分后收3個(gè)粒徑區(qū)間的蜂花粉：蜂花粉A組：未通過100目篩網(wǎng)組分；蜂花粉B組：過100目、未通過 250目篩網(wǎng)組分；蜂花粉C組：過250目篩網(wǎng)組分。

1.3.2 粒徑測(cè)定

蜂花粉B、C組用LS-POP激光粒度儀以蒸餾水作為分散劑濕法進(jìn)樣，測(cè)定顆粒的粒徑大小及分布。

1.3.3 顯微結(jié)構(gòu)觀察

樣品固定后表面噴金處理，將其置于掃描電子顯微鏡下觀察，并參考張全龍等[11]的方法通過顯微觀察測(cè)定破壁率。

1.3.4 體外模擬消化過程

參照GULLON等[12]的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況稍作改動(dòng)。

模擬口腔消化：準(zhǔn)確稱取1.200 g原料于10 mL離心管中，分別加入0.5 mL模擬唾液(用 1 mmol/L CaCl2配置100 U/mL α-淀粉酶溶液，并用1 mol/L NaHCO3調(diào)至pH 6.9)和4.5 mL蒸餾水，混合均勻后，置于37 ℃ 50 r/min振搖2 min。

模擬胃液消化：模擬口腔消化后，向管中滴加6 mol/L HCl調(diào)至pH 2，加入0.5 mL模擬胃液(0.108 g 胃蛋白酶溶于10 mL 0.1 mol/L HCl溶液)混合均勻后，置于恒溫振蕩器37 ℃ 50 r/min振搖2 h。

模擬腸液消化：模擬口腔、胃液消化后，向管中滴加6 mol/L NaOH調(diào)至pH 7，分別加入1.2 mL模擬腸液(0.080 g胰蛋白酶溶于10 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液)和1.2 mL膽汁(500 mg膽鹽溶于10 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液)混合均勻后，置于恒溫振蕩器37 ℃ 50 r/min振搖2 h。

1.3.5 體外模擬消化過程各階段溶出多酚的提取

蜂花粉經(jīng)模擬口腔、胃、腸每步消化后3 500 r/min離心10 min，取上清液用蒸餾水定容，用于測(cè)定消化液中的溶出多酚含量。

1.3.6 體外模擬消化后殘留多酚的提取

經(jīng)體外模擬口腔、胃、腸消化結(jié)束后的殘余物轉(zhuǎn)移至3 kDa透析袋中，置于10 mmol/L NaCl溶液中37 ℃下透析過夜，3 500 r/min離心10 min。參考肖星凝等[13]方法，取沉淀加入1 mL 2 mol/ L NaOH溶液，充分?jǐn)嚢韬蟊芄庀? h，用濃鹽酸調(diào)至pH 2。加入2 mL乙酸乙酯并充分?jǐn)嚢?0 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)提取5次，合并上清液，抽濾后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容，-5 ℃保存?zhèn)溆茫糜跍y(cè)定殘留多酚含量及進(jìn)行HPLC圖譜分析。

1.3.7 多酚含量的測(cè)定

原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確稱取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容后得原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL容量瓶中，各加6 mL水，搖勻，再加0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻。1 min之后，加入20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液1.5 mL， 混勻后定容。在室溫下反應(yīng)10 min，于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=102.54x+0.005 1 (R2=0.999 2)。 樣品多酚含量測(cè)定的操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。

1.3.8 體外模擬消化后殘留多酚HPLC圖譜分析

參考曠慧等[14]方法，蜂花粉經(jīng)模擬口腔、胃、腸消化結(jié)束后的殘留多酚提取液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：純水-甲醇(體積比50∶50)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min； 每次進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.9 體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸

1.3.9.1 體外發(fā)酵培養(yǎng)液的配制

參考文獻(xiàn)[15]略作改動(dòng)，體外發(fā)酵培養(yǎng)液由微量培養(yǎng)液與痕量培養(yǎng)液以體積比100:1的比例使用前臨時(shí)配制，混勻(表1)。

表1 體外發(fā)酵培養(yǎng)液的組成

1.3.9.2 腸道發(fā)酵菌液的配制

采集3名日常飲食正常，未刻意服用益生素及抗生素等相關(guān)產(chǎn)品的健康成年人新鮮糞便。取20 g新鮮糞便與100 mL pH 6.5磷酸緩沖溶液充分混勻，用4層紗布過濾得腸道發(fā)酵菌液，密封后貯存于-20 ℃?zhèn)溆肹16]，使用前在37 ℃恒溫解凍。其中新鮮糞便的采集與處理需在1 h內(nèi)完成。

1.3.9.3 體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸過程pH值的測(cè)定

取經(jīng)體外模擬口腔、胃、腸消化結(jié)束后，透析過的殘余物10 mL，加入25 mL體外發(fā)酵培養(yǎng)液、25 mL腸道發(fā)酵菌液，混合均勻，密封，置于37 ℃厭氧條件下發(fā)酵24 h。期間每4 h測(cè)定其pH值，監(jiān)控其體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸過程中pH值變化。發(fā)酵結(jié)束后，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定其發(fā)酵產(chǎn)酸量。

1.3.9.4 體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸的測(cè)定

分別準(zhǔn)確量取乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配置成不同濃度梯度，過0.45 μm濾膜后進(jìn)HPLC分析。色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：0.02 mol/mL KH2PO4-甲醇(體積比為98∶2)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm，流速為1.0 mL/min；每次進(jìn)樣量：20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：乙酸y=575.54x+23.33(R2=0.999 4)；丙酸y=493.59x+36.56(R2=0.999 6)；丁酸y=513.01x+146.30(R2=0.998 5)。發(fā)酵液解凍后3 000 r/min 離心20 min取上清液，過0.45 μm濾膜后按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行HPLC分析。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試樣重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉樣品粒徑分布

蜂花粉原料，未粉碎，呈不規(guī)則團(tuán)狀物，顆粒直徑介于2.0～3.0 mm。蜂花粉A組為粉碎后未通過100目篩網(wǎng)組分，且因粒度相對(duì)較大不能采用激光粒度儀對(duì)其進(jìn)行粒徑分布測(cè)定，理論上其顆粒粒徑大于150 μm。蜂花粉B、C組采用激光粒度儀對(duì)其進(jìn)行粒徑測(cè)定，其粒徑大小及其分布情況如表2所示。蜂花粉B組95%粒徑約小于141 μm，蜂花粉C組95%粒徑約小于53 μm，蜂花粉C組的粒徑分布范圍更窄，顆粒均勻性更好。

表2 蜂花粉B、C組粒徑分布

注：D10、D50、D90、D95，分別表示在粒徑累積分布曲線上，10%、50%、90%、95%顆粒的直徑小于或等于此值。同一列中標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 蜂花粉樣品顯微結(jié)構(gòu)觀察

蜂花粉A、B、C組顯微結(jié)構(gòu)見圖1。蜂花粉A組細(xì)胞大小均勻，外觀形態(tài)完整，細(xì)胞表面凹凸結(jié)構(gòu)及其萌發(fā)溝清晰可見，未出現(xiàn)破壁。蜂花粉B組部分細(xì)胞外觀形態(tài)完整，可見表面凹凸結(jié)構(gòu)及萌發(fā)溝；部分細(xì)胞外壁自萌發(fā)溝裂開或完全分解為數(shù)塊殘片，細(xì)胞內(nèi)容物流出，通過顯微觀察計(jì)算細(xì)胞破壁率(67.11±0.04)%。 蜂花粉C組幾乎未見清晰萌發(fā)溝，細(xì)胞外壁自萌發(fā)溝裂開或完全分解為數(shù)塊殘片，細(xì)胞內(nèi)容物流出覆蓋在細(xì)胞表面，細(xì)胞破壁率(100±0.00)%。蜂花粉細(xì)胞內(nèi)壁主要為纖維素、果膠質(zhì)、半纖維素等，纖維類組分含量豐富[17]，蜂花粉B、C兩組細(xì)胞壁存在破裂的現(xiàn)象，則其纖維類組分結(jié)構(gòu)也勢(shì)必受到相應(yīng)破壞。

Ⅰ-細(xì)胞壁上的萌發(fā)溝；Ⅱ-破碎的細(xì)胞殘片；Ⅲ-細(xì)胞表面被流出的細(xì)胞內(nèi)容物所覆蓋圖1 蜂花粉A、B、C組顯微結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖(×2 000)

Fig.1 Scanning electron microscpoe images of bee pollen powders A,B,C (×2 000)

2.3 蜂花粉在體外模擬消化各階段的多酚溶出量

由表3可知，在體外模擬口腔、胃、腸消化過程中，每個(gè)階段消化液中的多酚溶出量均隨著蜂花粉粒徑的減小而增加。同時(shí)，蜂花粉多酚溶出量在經(jīng)模擬胃液消化后達(dá)到最高，經(jīng)模擬腸液消化后多酚含量降低。這與李俶、FULGENCIO等[18-19]研究相似，某些多酚組分在模擬腸液消化后有所損失，這可能與腸道的堿性環(huán)境和溶解氧相關(guān)。與經(jīng)胃液消化后相比，蜂花粉原料、A、B、C組經(jīng)腸液消化后多酚保留率分別為(75.64±0.44)%、(81.29±0.72)%、(80.79±0.40)%、(81.70±0.65)%。胃腸消化環(huán)境較為復(fù)雜，粒徑不同，蜂花粉多酚溶出量不同；同時(shí)纖維類組分破裂情況不同，所得產(chǎn)物及其產(chǎn)生的空間阻礙，物質(zhì)之間相互作用等也不同?？傮w而言，粉碎有利于蜂花粉多酚在消化過程中的溶出，且提高了多酚在腸液消化過程的保留率。

表3 體外模擬消化各階段多酚溶出量

注：同一列中標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 蜂花粉在體外模擬消化后的多酚殘留量

研究表明，經(jīng)口腔、胃、腸消化吸收后的殘留多酚，可能以單體的形式通過物理吸附、截留，或與基質(zhì)通過化學(xué)鍵結(jié)合，這部分多酚則能到達(dá)大腸在腸道菌群作用下發(fā)揮功效[20-21]。由圖2可知，蜂花粉多酚殘留量隨粉碎粒徑的減小而增加。由圖1可知B、C兩組蜂花粉細(xì)胞壁存在破裂的現(xiàn)象，纖維類組分受到破壞，結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，可能更易于對(duì)多酚類物質(zhì)的物理吸附、截留，或化學(xué)結(jié)合。同時(shí)，粒徑越小，越易于與提取溶劑接觸，從而提取出的殘留多酚越多。

圖2 蜂花粉在體外模擬消化后多酚殘留量

Fig.2 Residual polyphenols contents of bee pollen after vitro digestion注：圖中標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.5 蜂花粉經(jīng)體外模擬消化后的殘留多酚HPLC圖譜

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件得到不同粒徑的蜂花粉經(jīng)體外模擬口腔、胃、腸消化后殘留多酚的HPLC疊加圖譜，見圖3。

S1-蜂花粉原料；S2-蜂花粉A組；S3-蜂花粉B組；S4-蜂花粉C組圖3 蜂花粉殘留多酚HPLC圖譜

Fig.3 HPLC chromatograms of residual polyphenols of bee pollen

蜂花粉原料與A、B、C組殘留多酚的HPLC圖譜峰形相似，出峰時(shí)間相近，在7.231、10.455、30.023 min附近均出現(xiàn)較大吸收峰。且通過圖譜匹配，4個(gè)樣品殘留多酚的HPLC圖譜兩兩之間相似度評(píng)價(jià)值在0.93 以上。同時(shí)，蜂花粉原料組在13.362、17.900、21.539、33.461 min附近出現(xiàn)了蜂花粉A、B、C組所沒有的吸收峰；蜂花粉A、B、C組在6.250、7.528、9.801 min 附近均出現(xiàn)了原料組所沒有的吸收峰；且蜂花粉A、B、C組之間出峰也略有差異。故總體而言，4個(gè)樣品殘留多酚的HPLC疊加圖譜有較好的相關(guān)性，粉碎對(duì)其殘留多酚的組分也有一定影響。

2.6 蜂花粉體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸過程

蜂花粉經(jīng)體外模擬口腔、胃、腸消化結(jié)束后的殘余物在模擬腸道發(fā)酵過程中的pH值如圖4可知，在0～24 h內(nèi)發(fā)酵液pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，pH值從6.3降至6.0；其中0～16 h pH值降低趨勢(shì)較強(qiáng)，16～24 h降低趨勢(shì)減弱，趨于平緩。同時(shí)，發(fā)酵相同時(shí)間，粉碎粒徑越小發(fā)酵液pH值越低。圖5～圖7分別為蜂花粉體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸24 h后其乙酸、丙酸、丁酸的含量，結(jié)果表明，隨著蜂花粉粉碎粒徑的減小，其發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量越高。相對(duì)而言，粉碎粒徑對(duì)產(chǎn)生乙酸、丙酸的影響作用強(qiáng)于產(chǎn)生丁酸的影響作用。

圖4 體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)酸過程pH值變化

Fig.4 pH in vitro intestinal fermentation process

圖5 蜂花粉體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)乙酸含量

Fig.5 The content of acetic acid in vitro intestinal fermentation process

圖6 蜂花粉體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)丙酸含量

Fig.6 The content of propionic acid in vitro intestinal fermentation process

圖7 蜂花粉體外模擬腸道發(fā)酵產(chǎn)丁酸含量

Fig.7 The content of butyric acid in vitro intestinal fermentation process

多酚可影響腸道菌群的生長(zhǎng)，這與多酚結(jié)構(gòu)、含量、微生物的種類以及多酚的代謝物等因素相關(guān)[22]；同時(shí)，糖分是微生物生長(zhǎng)的必需組分，蜂花粉粉碎粒徑不同，經(jīng)模擬口腔、胃、腸消化后蜂花粉殘留物其糖分的種類與含量、分子質(zhì)量大小、碳鏈長(zhǎng)短等不同，影響腸道菌群生長(zhǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酸能力也不同[23]。從結(jié)果可知，在體外模擬后腸發(fā)酵產(chǎn)酸過程，蜂花粉粉碎粒徑越小，發(fā)酵液pH值越低，發(fā)酵產(chǎn)酸特性越好。

3 結(jié)論

以蜂花粉原料、蜂花粉A組(未破壁)、蜂花粉B組(破壁率(67.11±0.04)%)、蜂花粉C組(破壁率(100.00±0.00)%)4種不同粒徑蜂花粉為研究對(duì)象，通過體外模擬人體消化系統(tǒng)，研究粉碎粒徑對(duì)蜂花粉多酚在胃腸道中的溶出情況以及被腸道菌群利用發(fā)酵產(chǎn)酸特性的影響。

在體外模擬消化過程中，各階段消化液中溶出多酚量隨蜂花粉粉碎粒徑的減小而增加。溶出多酚先增加后降低，在模擬胃液消化后達(dá)到最高，隨后在模擬腸液消化后降低。與模擬胃液消化后相比，粉碎提高了蜂花粉在腸液消化過程中溶出多酚的保留率。經(jīng)體外模擬口腔、胃、腸消化后，蜂花粉中殘留多酚含量隨著粉碎粒徑的減小而增加，其HPLC疊加圖譜有較好的相關(guān)性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)粉碎處理對(duì)其殘留的多酚組分有一定影響，具體差異性還需進(jìn)一步研究確定。在體外模擬后腸發(fā)酵過程，蜂花粉粉碎粒徑越小，發(fā)酵液的pH值越低，發(fā)酵產(chǎn)酸特性越好；且粉碎粒徑對(duì)產(chǎn)生乙酸、丙酸的促進(jìn)作用強(qiáng)于對(duì)產(chǎn)生丁酸的促進(jìn)作用。至今研究者對(duì)蜂花粉破壁與否還存在不同觀點(diǎn)，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在蜂花粉多酚的體外消化特性上破壁優(yōu)于未破壁。

膳食纖維可通過物理包裹、化學(xué)結(jié)合多酚類化合物，從而影響其在胃腸道的消化吸收[24-25]，且蜂花粉中含有豐富的纖維類組分[17]，故本研究中粉碎粒徑對(duì)油菜蜂花粉在模擬消化過程中多酚溶出及其殘留的影響，可能與粉碎對(duì)蜂花粉中膳食纖維類組分的影響相關(guān)。因此后續(xù)將對(duì)粉碎粒徑對(duì)蜂花粉膳食纖維類組分的影響做進(jìn)一步研究。