余飛，孫俊峰，劉鵬飛，劉艷，王洲，薛正蓮

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖,241000)

硫酸新霉素(neomycin sulfate)是首個被發(fā)現(xiàn)的2-DOS氨基糖苷類抗生素[1-2]，作為一種理想的干擾蛋白質(zhì)合成的殺菌劑，硫酸新霉素在臨床和獸醫(yī)學中有著廣泛的應用[3-5]。當今發(fā)酵工業(yè)中，誘變育種是提高菌種生產(chǎn)能力，使所需要的代謝產(chǎn)物過量積累的有效方法之一。而高通量篩選是誘變后能從大量突變株中快速篩選高產(chǎn)菌株的關鍵步驟。

目前在工業(yè)上微生物突變株的篩選工作中常用的是隨機篩選或者理化性質(zhì)篩選，然后再利用搖瓶發(fā)酵，逐個篩選[6-7]。傳統(tǒng)的篩選方法工作量大、篩選效率低、成本大，而近些年發(fā)展起來的微孔板的高通量篩選技術以微孔板為載體，目前已廣泛地應用在放線菌生物活性物質(zhì)篩選、菌種的篩選以及新藥的研發(fā)等方面[8-11]，它兼具平行、微型及自動等特點；而與分光光度計[12-13]、高效液相色譜(HPLC)[14-15]和管碟法[16]等相比，酶標儀可以1次處理大量的樣品，同時需要量少，可以節(jié)約試劑的使用；這些方法在篩選高產(chǎn)突變株的工作中都可以提高篩選效率，為高通量篩選硫酸新霉素高產(chǎn)菌株提供了較好的參考。

目前關于高通量篩選硫酸新霉素高產(chǎn)菌株的研究尚未見報道，因此，本研究采用新型常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)育種方法[17-20]誘變硫酸新霉素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌，建立多孔板發(fā)酵及酶標儀檢測的高通量篩選模型(如圖1所示)，為后續(xù)高通量選育其他抗生素高產(chǎn)菌株提供實驗依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

弗氏鏈霉菌野生型(S.fradiaeGC6010)菌株及指示菌大腸桿菌均為實驗室保藏；HTS-T008孔板搖床，上海甘薇生物技術有限公司；1510全波長酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；ARTP誘變育種儀，清華大學無錫應用技術研究院生物育種研究中心；硫酸新霉素標準品(642 U/mg)，安徽新宇藥業(yè)股份有限公司。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏1，蛋白胨3，玉米漿3，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.3～7.8，115 ℃滅菌30 min，30 ℃ 培養(yǎng)7 d。

種子培養(yǎng)基(g/L)：淀粉10，花生餅粉10，酵母粉20，(NH4)2SO41，葡萄糖30，玉米漿10，蛋白胨5，Na2HPO41，CaCO310，豆油2，pH 7.3～7.8，115 ℃滅菌30 min，2 mL/孔板、30 mL/250 mL搖瓶，35 ℃、260 r/min培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：淀粉70，花生餅粉28，酵母粉6，(NH4)2SO46，葡萄糖20，玉米漿2.5，蛋白胨9，中溫豆餅粉5，NaCl 4.5，高溫淀粉酶0.3，Na2HPO40.4， CaCO34，豆油3，pH 6.8～7.3，115 ℃滅菌30 min，2 mL/孔板、 30 mL/250 mL搖瓶，35 ℃、260 r/min培養(yǎng)7 d。

圖1 ARTP誘變育種流程圖Fig.1 Scheme of ARTP mutagenesis for microbial breeding

1.2 酶標儀測定硫酸新霉素方法的建立

1.2.1 硫酸新霉素測定原理及方法

實驗原理：硫酸新霉素與曲利本藍(TB)反應后，生成藍色離子締合物，并出現(xiàn)明顯的顯色峰，在一定波長下可測定待測溶液中硫酸新霉素效價[12]。

酶標儀：吸取發(fā)酵液200 μL于1.5 mL EP管中，加入1.0×10-4mol/L曲利本藍溶液500 μL，pH 6.5的BR緩沖液100 μL，用蒸餾水定容至1 mL，搖勻，10 min后吸取反應液200 μL于酶標板中，以試劑空白為參比，在最大吸收波長處檢測吸光度。

1.2.2 檢測波長的選擇

于1.5 mL EP管中，依次加入500 μL 1.0×10-4mol/L 的TB溶液，100 μL的25.68 U/mL的硫酸新霉素標準溶液，100 μL pH 6.5的BR緩沖溶液，用水稀釋至1 mL，搖勻，以試劑空白為參比，10 min 后在酶標儀下進行全波長掃描，確定反應物的最大吸收峰波長。

1.2.3 TB溶液添加量對吸光度的影響及標準曲線的建立

取25.68 U/mL的硫酸新霉素標準溶液50、100、150、200、250、300、350、400 μL，分別加入1.0×10-4mol/L TB溶液100、200、300、400、500 μL，100 μL pH 6.5的BR緩沖溶液，用水稀釋至1 mL，搖勻，以試劑空白為參比，10 min后在678 nm波長處檢測吸光度，確定反應體系的TB溶液添加量并建立標準曲線。

1.2.4 精密度試驗

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為2份，分別加入25.68 U/mL硫酸新霉素工作液75 μL和375 μL，制備待測溶液，按優(yōu)化后的方法在678 nm波長下使用酶標儀檢測吸光度值，計算硫酸新霉素效價，每組樣品設置5個重復。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗

吸取25.68 U/mL硫酸新霉素工作液200 μL，置1.5 mL EP管中，按優(yōu)化后的方法，放置0、10、20、30、40、50、60 min，在678 nm波長處測定其吸光度。

1.2.6 加標回收試驗

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為5份，分別加入25.68 U/mL硫酸新霉素工作液75、125、175、225、275、325、375 μL，制備待測溶液，按優(yōu)化后的方法在678 nm波長下使用酶標儀檢測吸光度值，計算回收率。

1.2.7 酶標儀與其他3種方法測定硫酸新霉素的擬合驗證

按優(yōu)化后的方法在678 nm下，分別使用酶標儀、分光光度計、HPLC和管碟法測定由ARTP誘變所獲得的25株突變株經(jīng)24孔板發(fā)酵后其中的硫酸新霉素效價，并利用Origin9.1軟件對酶標儀與其他3種方法所測硫酸新霉素效價進行擬合曲線分析。

1.3 多孔板發(fā)酵

1.3.1 孔板類型的選擇及優(yōu)化

本實驗隨機挑選經(jīng)ARTP誘變后的29株突變株，通過對其24、48孔板與搖瓶發(fā)酵效價之間相關性的對比，選擇更適合高通量篩選的微孔板，并對所選擇的孔板發(fā)酵條件進行正交優(yōu)化。

1.3.2 微孔板孔間差異考察

采用S.fradiaeGC6010菌株的均一搖瓶發(fā)酵液上清，通過酶標儀進行檢測，對檢測的樣本用Origin 9.1軟件進行獨立樣本的t-Test，考察酶標板孔間差異；若差異不大，再用同一菌株的24孔板發(fā)酵上清去檢測，考察24孔板孔間差異大小。

2 結果與分析

2.1 酶標儀測定硫酸新霉素方法的建立

2.1.1 檢測波長的選擇

由圖2可見，硫酸新霉素與曲利本藍反應形成的藍色絡合物在678 nm波長處有最大吸收峰，故選擇678 nm為檢測波長。

圖2 硫酸新霉素紫外吸收圖譜Fig.2 UV absorption spectra of NM

2.1.2 TB溶液添加量對吸光度的影響及標準曲線的建立

如圖3-a與圖3-b所示，當硫酸新霉素濃度在1.284～10.272 U/mL內(nèi)，TB的添加量在100～400 μL/mL時，都不滿足硫酸新霉素含量與吸光度呈線性關系，可能是因為使體系中硫酸新霉素完全形成藍色絡合物，TB必須達到過飽和。

圖3 TB溶液添加量對吸光度的影響及標準曲線的建立Fig.3 The influence of TB on absorbance and establishment of standard curve

而由于TB的添加量不夠，不足以使反應進行完全；只有當TB的添加量達到500 μL時，吸光度與樣品濃度呈良好的線性關系，線性方程為：Y=0.032 0X-0.026 2 (R2=0.998 8)。因此，本試驗TB的添加量采用500 μL/mL。

2.1.3 精密度試驗

為了盡可能減少實驗誤差，使得試驗更準確，提高試驗精密度在工業(yè)檢測中是必不可少的。由表1可知，各組在低濃度和高濃度的RSD均小于0.5%，表明該方法測定硫酸新霉素效價精密度高。

表1 精密度試驗Table 1 Accuracy examinations

2.1.4 穩(wěn)定性試驗

從表2可知，體系中剛剛滴加完硫酸新霉素與TB反應后立即檢測，藍色絡合物的形成并未達到飽和，吸光度偏??；反應10 min后，藍色絡合物幾乎達到飽和，吸光度達到最大值。在實際過程中，檢測誘變后大量突變株經(jīng)孔板發(fā)酵后效價需要一定的操作時間，而從表2可知，硫酸新霉素工作液在10～60 min吸光度基本保持不變，穩(wěn)定性良好，滿足實際需求。

表2 硫酸新霉素工作液的穩(wěn)定性試驗結果Table 2 The stability test of NM working solution

2.1.5 加標回收試驗

為了驗證樣品的前處理過程是否對樣品的測定產(chǎn)生影響以及測量過程中是否有基體干擾，必須進行加標回收試驗。由表3可知，平均回收率為98.468 4%，RSD為3.270 0%。結果表明，采用酶標儀測定硫酸新霉素加樣回收率較高，前處理過程及水溶液基體對樣品的測定影響幾乎忽略不計。

表3 加標回收率Table 3 Recoveries of spiked sample

2.1.6 酶標儀與其他3種方法測定硫酸新霉素的擬合驗證

相關強度由相關系數(shù)的絕對值決定，相關系數(shù)的正負系數(shù)是相關方向。根據(jù)經(jīng)驗，統(tǒng)計學家提出了相關性強度的判斷標準，將R2= 0.7作為1個較高的相關系數(shù)[21]。由圖4可知，擬合曲線的R2=0.940 7、0.911 7和0.927 9，表明酶標儀與分光光度計、HPLC與管碟法測定24孔板發(fā)酵液中硫酸新霉素效價具有很好的正相關性，可以利用酶標儀快速、高效測定較多發(fā)酵樣品中硫酸新霉素的效價。

a-酶標儀與分光光度計法；b-酶標儀與HPLC法；c-酶標儀與管碟法圖4 酶標儀與其他3種方法測定硫酸新霉素效價之間的相關性Fig.4 The relationship between microplate reader and other three methods for determination of NM potency

2.2 多孔板發(fā)酵

2.2.1 孔板類型的選擇

如何從數(shù)量龐大的突變株中省時、省力地篩選出生產(chǎn)性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，是菌株篩選工作的關鍵。本實驗隨機挑選經(jīng)ARTP誘變后的29株突變株，通過對其24、48孔板與搖瓶發(fā)酵效價之間相關性的對比，選擇更適合高通量篩選的微孔板，結果見圖5。

a-24孔板發(fā)酵；b-48孔板發(fā)酵圖5 突變株24、48孔板效價與搖瓶效價之間的相關性Fig.5 The relationship between potency of different microplates and shake flask

由圖5結果可知，在樣本數(shù)為29時，搖瓶與24、48孔板發(fā)酵效價的相關性分別達到0.882 3、 0.842 9，相關性都較良好，但24孔板的發(fā)酵效價比48孔板更接近搖瓶，所以為提高硫酸新霉素產(chǎn)生菌選育的效率，選擇24孔板作為硫酸新霉素高產(chǎn)突變體快速篩選的工具，后續(xù)的實驗需要對24孔板發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高24孔板發(fā)酵單位。

2.2.2 微孔板孔間差異考察

本試驗均采用的是同一菌株，由表4可知，在P=0.05顯著水平下，酶標板孔間差異不顯著；由表5可知，在酶標板孔間差異不顯著以及P=0.05顯著水平下，24孔板孔間差異不顯著。因此，在復篩過程中可排除系統(tǒng)誤差。

表4 酶標板孔間差的t檢驗結果Table 4 The result of t-Test on difference between the holes of ELISA plate

表5 24孔板孔間差的t檢驗結果Table 5 The result of t-Test on difference between the holes of 24-well microplate

2.2.3 孔板發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)弗氏鏈霉菌產(chǎn)硫酸新霉素發(fā)酵過程中對氧的需求量較大，而轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量都對溶氧有一定的影響，基于前期單因素[22]預實驗，本試驗選定轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量3種因素作為考察對象，選擇3個水平，采用L9(34)正交實驗設計方法[23-24]。因素水平見表6，24孔板發(fā)酵結果見表7。

表6 因素水平表Table 6 Factor level table

表7 24孔板發(fā)酵結果與分析Table 7 The result and analysis of 24-well microplate plate fermentation

由表7試驗結果的極差分析得知，3個因素對弗氏鏈霉菌產(chǎn)硫酸新霉素發(fā)酵水平的影響主次順序為A>B>C(即轉(zhuǎn)速>裝液量>接種量)。正交試驗的最優(yōu)組為試驗6，而直觀分析得出的最優(yōu)組為A2B2C1，將試驗組6、A2B2C1與原發(fā)酵條件對照組進行3次同期24孔板對比試驗，得到硫酸新霉素發(fā)酵效價試驗組A2B2C1>6>對照組，試驗組A2B2C1平均效價為(6 825±77) U/mL，比對照組的(5 357±68) U/mL 提高了27.40%，由此可見，該試驗方案穩(wěn)定可行，最后得出24孔板最優(yōu)結果為：接種量為8%，轉(zhuǎn)速為220 r/min，裝液量為2 mL。

3 討論

目前文獻報道關于硫酸新霉素的檢測方法主要包括：(1)高效液相色譜法。在抗生素的含量與雜質(zhì)的測定中，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、測定結果準確、使用范圍廣，在食品殘留硫酸新霉素的檢測中，這種方法檢測效果良好，也適合在科研中有高準確度測定要求中使用；(2)微生物法。在靈敏度及多樣品處理時表現(xiàn)較好，可用于硫酸新霉素產(chǎn)生菌菌種選育，但是這種測定方法的影響因素多，測定耗時長，故在工業(yè)生產(chǎn)中使用較少；(3)分光光度計法。在硫酸新霉素產(chǎn)量的測定中，簡單、準確，適合工業(yè)中使用。但以上方法大多成本高、周期長、操作復雜，不宜用于大批量樣品的檢測。而酶標儀滿足吸光物質(zhì)濃度在一定波長下與吸光度成線性相關的規(guī)律，是實驗室常用的設備[25]，適用于物質(zhì)的檢測定量分析，且能夠一次性快速檢測大量的樣品，在硫酸新霉素高產(chǎn)菌株的選育中具有高效性。

對于菌種的選育工作來說，高產(chǎn)突變株的篩選是一項重要的工作，篩選方法的選擇對于篩選的效率有著重要的影響。而近些年來基于微孔板的高通量篩選已廣泛應用于各個方面，同一塊微孔板可以提供大量有相同的流體動力學特性和相同形狀的微型生物反應器，這使得在試管、搖瓶上的菌體培養(yǎng)可以在微型化的孔板上進行。JOHN等通過對谷氨酸棒狀桿菌的96微孔板發(fā)酵培養(yǎng)測得該培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣傳遞速率，并發(fā)現(xiàn)了在微孔板、搖瓶以及發(fā)酵罐培養(yǎng)的生長參數(shù)具有良好的一致性[26]。同時，由于微孔板體積小、裝液量少，因此篩選大量突變株時耗費的培養(yǎng)基及樣品量也少，同時檢測時需要的試劑量也減少，這極大節(jié)省了篩選的成本。

本文基于多孔板發(fā)酵及酶標儀檢測高通量選育模型，成功建立酶標儀測定發(fā)酵液中硫酸新霉素的方法，并對24孔板發(fā)酵條件進行單因素和正交優(yōu)化，使優(yōu)化后硫酸新霉素的效價較原發(fā)酵條件提高了27.40%。