楊媛媛，潘建龍，宴正明，張潤(rùn)光，張有林*

1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710000)2(安康市瀛天生態(tài)農(nóng)林開發(fā)有限公司，陜西 安康，725000) 3(陜西省林業(yè)科學(xué)研究院，陜西 西安，710000)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬植物，為世界四大干果之一。核桃仁中蛋白質(zhì)含量高達(dá)15%～25%，具有健胃、補(bǔ)血、潤(rùn)肺、養(yǎng)神等功效，被稱為是天然營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品[1-2]。核桃仁冷榨取油后的副產(chǎn)物核桃粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)54%[3]，但目前未得到充分利用，造成資源浪費(fèi)。乳酸菌發(fā)酵食品具有降低血糖，調(diào)節(jié)腸胃，增強(qiáng)免疫等功能[4]。利用乳酸菌發(fā)酵植物蛋白開發(fā)集蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與乳酸菌保健功能于一體的新型發(fā)酵飲料，可成為開發(fā)利用核桃的一種新途徑。

關(guān)于酸性植物蛋白飲料的研究有諸多報(bào)道，王才華等[5]對(duì)大豆蛋白乳酸菌飲料的制備工藝進(jìn)行了研究；李博等[6]選育出一株蛋白酶活性高，發(fā)酵活力好的乳桿菌株用于制備花生酸乳。酸性蛋白飲料中蛋白質(zhì)易沉淀，目前主要通過添加穩(wěn)定劑解決這一問題。不同穩(wěn)定劑對(duì)酸乳體系的性質(zhì)、產(chǎn)品的口感影響很大，實(shí)際生產(chǎn)中添加單一穩(wěn)定劑效果很不理想，往往需要復(fù)配使用[7]。NTAZINDA等[8]研究，將羧甲基纖維素鈉和可溶性大豆多糖復(fù)配，有效降低了沉淀率和平均粒徑，改善了產(chǎn)品的口感。KIANI等[9]將結(jié)冷膠與果膠復(fù)配，極大延長(zhǎng)了酸性乳飲料的貨架期。LIU等[10]將可溶性大豆多糖和果膠復(fù)配，結(jié)果表明果膠的加入限制了可溶性大豆多糖吸附到酪蛋白上，不利于酸乳的穩(wěn)定。因此復(fù)配穩(wěn)定劑效果不一，需進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上篩選出生產(chǎn)核桃粕多肽酸乳飲料理想的單一穩(wěn)定劑羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)、高酯果膠(high methoxyl pectin，HMP)和阿拉伯膠(gum arabic，GA)，進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，并通過測(cè)定產(chǎn)品流變學(xué)特性、觀察微觀結(jié)構(gòu)變化和感官鑒評(píng)，確定最佳復(fù)配方案，旨在為復(fù)合穩(wěn)定劑的研究提供理論基礎(chǔ)，為核桃粕多肽酸乳飲料的開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

核桃為香菱品種由西安市核桃良種繁育基地提供；風(fēng)味蛋白酶為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；乳酸菌發(fā)酵劑為昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司產(chǎn)品；CMC-Na為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；HMP為丹尼斯克(上海)公司產(chǎn)品；GA為鄭州裕和食品添加劑有限公司產(chǎn)品；白砂糖、牛奶為市售。以上材料均為食品級(jí)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JM-50型膠體磨，西安永興食品藥化機(jī)械公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱由上海一恒科技有限公司；MK3型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司；AR-G2型流變儀，美國(guó)TA公司；黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield有限公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；BI-90Plus激光粒度儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃粕多肽酸乳飲料制備工藝

1.2.2 操作要點(diǎn)

(1)乳酸菌的活化及馴化

參考楊勝敖等[11]的方法。菌種活化：取脫脂乳5 mL，裝于試管，塞口，121 ℃殺菌20 min。冷卻后，加入1 g/L的發(fā)酵劑菌粉，置于37 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)12 h。菌種的馴化：采用梯度濃度馴化法，將活化的乳酸菌菌種(接種量為4%)依次接入含核桃酶解液與脫脂乳質(zhì)量比為5∶5、 6∶4、7∶3、8∶2、 9∶1、10∶0 的混合物中，37 ℃培養(yǎng)至凝乳。經(jīng)多次馴化，直至混合菌種生長(zhǎng)良好，凝乳快，才可作為生產(chǎn)發(fā)酵劑。-18 ℃凍藏備用。

(2)核桃粕酶解液的制備

酶解:稱取定量核桃粕與沸水按比例1∶12(g∶mL)混合，充分?jǐn)嚢?，待冷卻后加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH至6.0，加入風(fēng)味蛋白酶，在50 ℃下保溫水解。

滅酶：酶解液沸水浴20 min。

(3)核桃酶解液的發(fā)酵

在上述制備好的酶解液中加入牛奶、白砂糖、穩(wěn)定劑等，均質(zhì)， 70 ℃殺菌30 min，冷卻后接種一定量的乳酸菌發(fā)酵。在4 ℃下冷藏后熟，取樣分析。

1.2.3 核桃粕多肽酸乳飲料穩(wěn)定性研究

單因素試驗(yàn)：對(duì)前期篩選出的CMC-Na、HMP和GA三種穩(wěn)定劑，考察添加量對(duì)樣品穩(wěn)定性、感官評(píng)分、黏度和粒徑的影響，綜合評(píng)價(jià)各穩(wěn)定劑的效果。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對(duì)3種穩(wěn)定劑進(jìn)行復(fù)配，確定出最佳配方。

1.2.4 穩(wěn)定系數(shù)的測(cè)定

參考周文化等[12]的方法：離心機(jī)將樣品在3 000 r/min離心10 min，分別取離心后的上清液和核桃粕多肽酸乳飲料，稀釋100倍，在501 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，穩(wěn)定系數(shù)按公式(1)計(jì)算。

(1)

1.2.5 綜合評(píng)分方法

參考馬永軒等[13]的方法，對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料樣品隨機(jī)編號(hào)，并分裝到專用品評(píng)杯中，食品專業(yè)的品評(píng)員10名，對(duì)樣品按表1進(jìn)行感官評(píng)分，按公式(2)計(jì)算每個(gè)樣品的綜合評(píng)分值。

綜合評(píng)分=穩(wěn)定系數(shù)×30%+感官評(píng)分×70%

(2)

表1 感官評(píng)分表Table 1 Sensory score sheet

1.2.6 黏度測(cè)定

將添加了不同濃度穩(wěn)定劑的核桃粕多肽酸乳飲料樣品攪拌均勻，用黏度計(jì)測(cè)定，設(shè)置轉(zhuǎn)速200 r/min，測(cè)定溫度15 ℃，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.2.7 粒徑測(cè)定

添加不同濃度穩(wěn)定劑的樣品冷藏1d后，利用Brookhaven BI-90 Plus激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑分布情況。

1.2.8 流變學(xué)研究

參考張雅媛等[14]和CUI等[15]的方法作以下改動(dòng)：采用穩(wěn)態(tài)模式，剪切速率0.1～100 s-1，溫度25 ℃，每10 倍頻率取10 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，測(cè)定黏度及剪切力隨剪切速率的變化。對(duì)添加復(fù)配穩(wěn)定劑的核桃粕多肽酸乳飲料樣品及未添加穩(wěn)定劑的樣品每次取樣1.5 mL，進(jìn)行流變學(xué)特性研究。

1.2.9 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考侯俊杰[16]的方法，將新制備的樣品和儲(chǔ)存7 d的樣品，每毫升加入40 μL尼羅藍(lán)染液對(duì)蛋白質(zhì)染色30 min，在激發(fā)波長(zhǎng)633 nm條件下放大40倍，用激光共聚焦顯微鏡觀察添加復(fù)配穩(wěn)定劑的樣品及未添加穩(wěn)定劑的樣品中蛋白質(zhì)分布及微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin 8.5軟件分析和繪圖，并采用Duncan’s進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，差異顯著水平取0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC-Na、HMP和GA對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料品質(zhì)的影響

不同穩(wěn)定劑添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料綜合評(píng)分的影響見圖1。由圖1看出，添加單一穩(wěn)定劑與不添加穩(wěn)定劑相比，綜合評(píng)分均顯著增加(P<0.05)。由圖1-A看出樣品的綜合評(píng)分隨著CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，添加量為1.2 g/L時(shí)，樣品綜合評(píng)分為78.01。其原因是CMC-Na屬陰離子多糖，在酸性條件下吸附于蛋白質(zhì)表面，該吸附層提供的空間位阻效應(yīng)維持了體系穩(wěn)定，隨著CMC-Na添加量的增加，穩(wěn)定體系被破壞，口感變差[17]。

圖1 三種穩(wěn)定劑不同添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different addition amount of three stabilizers on quality of walnut polypeptide yogurt drink

由圖1-B看出，樣品的綜合評(píng)分隨著HMP添加量的增加先上升后逐漸趨于平緩，添加量為0.9 g/L時(shí)，綜合評(píng)分為80.35，這與NAKAMURA等[18]研究結(jié)果一致，其原因是HMP與蛋白質(zhì)復(fù)合膠粒間的靜電排斥作用維持著酸乳體系穩(wěn)定，添加量太高，會(huì)增加酸乳的黏稠感。由圖1-C可以看出，隨著GA添加量的增加樣品綜合評(píng)分呈先上升后下降，添加量為70 g/L 時(shí)，樣品的綜合評(píng)分為80.03，因?yàn)槭窃谒嵝原h(huán)境中GA能夠通過靜電作用與部分蛋白質(zhì)結(jié)合，隨著GA添加量的增加，樣品中會(huì)出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，體系失穩(wěn)。

2.2 CMC-Na、HMP和GA對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響

3種穩(wěn)定劑的添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響見圖2。

圖2 三種穩(wěn)定劑不同添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響Fig.2 Effect of different adding quantity of stabilizers on the viscosity of walnut polypeptide yogurt drink

由圖2看出，樣品的黏度隨著CMC-Na、HMP、GA添加量的增加而增加。據(jù)TROMP等和KASTNER等[19-20]報(bào)道，其原因是在酸性環(huán)境中，CMC-Na、HMP和GA均可與酸乳中的部分蛋白質(zhì)形成靜電復(fù)合物，由靜電作用以及分子間的摩擦力增大，導(dǎo)致樣品黏度增加。

2.3 CMC-Na、HMP和GA對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料粒徑的影響

根據(jù)斯托克斯定律，顆粒的直徑越小，沉降速度越慢，體系越穩(wěn)定[21]。3種穩(wěn)定劑的添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料平均粒徑的影響見圖3。由圖3-A可以看出，隨著CMC-Na添加量的增加，樣品的平均粒徑呈先增大再減小最后增大的趨勢(shì)，添加量為1.2 g/L時(shí)，粒徑值最小為(1.26±0.01) μm，這是因?yàn)榈吞砑恿繒r(shí)，CMC-Na不能充分吸附于蛋白質(zhì)上，造成蛋白質(zhì)分子聚集，粒徑增大；當(dāng)其添加量為1.2 g/L時(shí)，足以覆蓋于蛋白質(zhì)表面，此時(shí)蛋白質(zhì)穩(wěn)定不聚集；當(dāng)添加量高于0.12%時(shí)，CMC-Na在蛋白質(zhì)上發(fā)生多層吸附，粒徑增大。由圖3-B可以看出，隨著HMP添加量的增加，樣品的平均粒徑顯著減小(P<0.05)，添加量為0.5 g/L時(shí)粒徑最小為(0.94±0.02) μm。這說(shuō)明在一定的添加量范圍內(nèi)，HMP和蛋白質(zhì)能夠通過靜電作用形成復(fù)合物，阻止蛋白質(zhì)分子聚集，減小粒徑，該結(jié)論與李向東等[22]關(guān)于HMP對(duì)含乳飲料粒徑的影響研究結(jié)果相一致。由圖3-C可以看出，隨著GA添加量的增加，樣品的平均粒徑呈先下降后上升再微下降的趨勢(shì)，添加量為50 g/L時(shí)，粒徑最小為(1.07±0.05) μm，這可能是GA分子為球形構(gòu)象，蛋白質(zhì)更易與其側(cè)鏈的羧酸基團(tuán)相互作用從而降低GA分子內(nèi)部的靜電斥力，使其收縮，但添加量繼續(xù)增加，復(fù)合物粒徑會(huì)增大。

圖3 三種穩(wěn)定劑不同添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料粒徑的影響Fig.3 Effects of different addition amount of threa stabilizers on particle size of walnut polypeptide yogurt drink

2.4 穩(wěn)定劑復(fù)配正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)CMC-Na、HMP、GA復(fù)配及添加量試驗(yàn)，采用L9(34)正交表，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以綜合評(píng)分為指標(biāo)評(píng)價(jià)穩(wěn)定劑復(fù)配效果，選出最優(yōu)組合及用量，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 穩(wěn)定劑配方優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 2 Stabilizer formula optimization test factor level table

表3 穩(wěn)定劑復(fù)配正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Stabilizer compounding orthogonal test results and analysis

由表3極差分析可知，穩(wěn)定劑對(duì)產(chǎn)品綜合評(píng)分影響的主次順序?yàn)椋篏A>HMP>CMC-Na，最佳組合為A1B1C3， 即CMC-Na添加量1 g/L、HMP添加量0.9 g/L、GA添加量70 g/L。在此條件下又進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得核桃粕多肽酸乳飲料的穩(wěn)定系數(shù)為80.21，感官得分為82.20，綜合評(píng)分為81.60，與表3中最高綜合評(píng)分差異不顯著(P<0.05)，綜合考慮，最終復(fù)配選用A1B1C3。

2.5 核桃粕多肽酸乳飲料流變學(xué)特性

采用AR-G2型流變儀測(cè)定添加最佳復(fù)配穩(wěn)定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料樣品的流變學(xué)特性，作出黏度-剪切速率，剪切應(yīng)力-剪切速率的關(guān)系圖，見圖4。

A-黏度—剪切速率；B-剪切應(yīng)力—剪切速率圖4 核桃粕多肽酸乳飲料的黏度—剪切速率和剪切應(yīng)力—剪切速率曲線圖Fig.4 Viscosity-shear rate and shear stress-shear rate profile of walnut polypeptide yogurt drink

由圖4-A看出，添加復(fù)配穩(wěn)定劑后，核桃粕多肽酸乳飲料黏度隨著剪切速率的升高而降低，最后趨于平緩，而復(fù)配前的樣品黏度隨著剪切速率的增加先減小后基本保持不變，直至和水的黏度相等。由圖4-B看出，復(fù)配后的核桃粕多肽酸乳飲料剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增大而增大，而未復(fù)配樣品剪切應(yīng)力變化趨勢(shì)和水接近。根據(jù)牛頓剪切應(yīng)力公式可以判斷，添加復(fù)配穩(wěn)定劑后，核桃粕多肽酸乳飲料出現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象，反映出非牛頓流體特性，屬假塑性流體。未添加復(fù)配穩(wěn)定劑的樣品，在高剪切速率下，呈現(xiàn)出牛頓流體的特性[23-24]。綜合圖4-A、圖4-B看出，加入穩(wěn)定劑后核桃粕多肽酸乳飲料黏度顯著增加(P<0.05)。

2.6 核桃粕多肽酸乳飲料微觀結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)對(duì)添加復(fù)配穩(wěn)定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料通過激光共聚焦顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 核桃粕多肽酸乳飲料激光共聚焦顯微鏡圖Fig.5 Laser confocal microscopy of walnut peptide polypeptide milk drink注：比例尺子-100 μ m。

圖5-A、圖5-B分別為儲(chǔ)藏0 d添加復(fù)配穩(wěn)定劑前后的樣品圖像。由圖5可知，未添加穩(wěn)定劑的樣品，蛋白凝聚，分布松散不均一，添加復(fù)配穩(wěn)定劑的樣品蛋白質(zhì)粒徑明顯減小，且分布更為密集。該結(jié)果與盛林霞[25]對(duì)酸性乳飲料中穩(wěn)定劑復(fù)配機(jī)理的研究結(jié)論一致，其原因是復(fù)配穩(wěn)定劑間產(chǎn)生協(xié)同作用，使體系具有更好的均一穩(wěn)定性。

圖5-C為貯藏7 d時(shí)未復(fù)配樣品的圖像，與圖5-A相比蛋白絮凝現(xiàn)象更為明顯；圖5-D中蛋白質(zhì)粒徑無(wú)明顯增加，聚集現(xiàn)象得到改善，但均一性比圖5-B差，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是乳酸菌造成酸乳體系后酸化，部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)“塌陷”，空間位阻效應(yīng)減弱，空間排斥力逐漸小于范德華吸引力，出現(xiàn)聚集，體系失穩(wěn)沉淀。

3 結(jié)論

CMC-Na、HMP和GA三種穩(wěn)定劑及其添加量對(duì)核桃粕多肽酸乳飲料感官、穩(wěn)定性、黏度和粒徑的影響各不相同，總體表現(xiàn)為添加了穩(wěn)定劑綜合評(píng)分、黏度均顯著上升，體系呈最穩(wěn)狀態(tài)時(shí)樣品的平均粒徑較未添加穩(wěn)定劑時(shí)顯著減小。

復(fù)配穩(wěn)定劑的穩(wěn)定效果優(yōu)于單一穩(wěn)定劑，CMC-Na、HMP和GA三種穩(wěn)定劑復(fù)配提高了核桃粕多肽酸乳飲料的穩(wěn)定性，改善了口感，以添加1.2 g/L CMC-Na、0.9 g/L HMP、70 g/L GA時(shí)效果最佳。

經(jīng)對(duì)添加復(fù)配穩(wěn)定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料樣品的流變學(xué)特性研究，樣品添加復(fù)配穩(wěn)定劑后由牛頓流體轉(zhuǎn)變?yōu)榉桥ｎD流體，黏度增加蛋白質(zhì)絮凝減少，產(chǎn)品穩(wěn)定性提高。