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      人重鏈鐵蛋白偶聯(lián)HER2抗體的純化及其在成像中的初步應(yīng)用

      2019-05-07 09:46:18殷惠陳龍張文遠朱新杰許諾王婷婷盛復(fù)庚
      生物技術(shù)通訊 2019年2期
      關(guān)鍵詞:重鏈偶聯(lián)鐵蛋白

      殷惠,陳龍,張文遠,朱新杰,許諾,王婷婷,盛復(fù)庚

      1.安徽醫(yī)科大學(xué) 解放軍307臨床學(xué)院,北京 100071;2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)放射科,北京 100071;3.北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,北京 100871

      近年來,隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來越多的納米材料用于癌癥的靶向成像及治療,但普遍存在安全性及生物相溶性差的缺點[1]。鐵蛋白是人體內(nèi)普遍存在的鐵代謝蛋白,生理狀態(tài)下形成24 聚體的籠狀結(jié)構(gòu),內(nèi)外徑分別為8、12 nm,其內(nèi)部空腔可以載藥[2-4]。鐵蛋白作為藥物載體具有生物相容性高及易于工程改造的優(yōu)點[5]。目前,很多研究以鐵蛋白作為載體,包載治療或成像藥物,進行癌癥的診斷或治療[6]。其機理主要是借助重鏈鐵蛋白(heavy chain ferritin,HFn)與人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)結(jié)合,發(fā)揮其功能[7]。但從靶向腫瘤遞送角度,需要增加鐵蛋白的靶向性,使其更好地定位于腫瘤細胞,因而提高其靶向性也是目前關(guān)注的熱點之一。通過不同靶向配體的化學(xué)修飾,或遺傳修飾的方法提高鐵蛋白的靶向性,已經(jīng)取得了一些成功。相關(guān)報道如在鐵蛋白表面修飾RGD,通過RGD 與整合素αⅤβ3的結(jié)合,將鐵蛋白靶向癌細胞;或?qū)㈣F蛋白與細胞黏附分子偶聯(lián),靶向內(nèi)皮,從而提高對肺血管系統(tǒng)的靶向等[8-9]。單克隆抗體作為特異性的靶向分子,將鐵蛋白與臨床常用抗體偶聯(lián),既可以提高鐵蛋白的靶向性,也有利于將鐵蛋白納米材料向臨床轉(zhuǎn)化。

      人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)是臨床上許多腫瘤如乳腺癌、胃癌等的重要治療靶點。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,我國的乳腺癌發(fā)病率逐年上升,并且患者中的15%~23%表現(xiàn)為HER2 陽性[10]。曲妥珠單抗(商品名為赫賽汀)作為一種人源化的單克隆抗體,可以特異地與表面高表達HER2的乳腺癌細胞結(jié)合,進而通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(antibody-depen?dent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)產(chǎn)生抗腫瘤活性,是臨床治療乳腺癌的主要方式之一[11-12]。雖然曲妥珠單抗的靶向治療改善了HER2 陽性乳腺癌患者的預(yù)后,但仍有相當一部分患者會復(fù)發(fā)并死亡。目前,除了繼續(xù)研究靶點不同的分子靶向藥物,針對關(guān)鍵基因、信號通路等的研究也在探索中。但臨床研究更傾向于將不同機制靶向藥物進行聯(lián)合治療,如將靶向藥物與化療藥物聯(lián)合使用,或?qū)邢蛩幬锱c內(nèi)分泌聯(lián)合治療等[13]。盡管有關(guān)曲妥珠單抗治療的臨床數(shù)據(jù)豐富,但許多重要問題仍未得到解決,包括最佳治療持續(xù)時間,以及如何最好地將曲妥珠單抗與細胞毒性試劑和其他藥劑聯(lián)合使用以最大限度地提高療效,同時盡量減少毒性等。2016年有關(guān)MM-302的實驗已進入臨床試驗階段,主要是設(shè)計一種既有HER2 陽性細胞靶向性,又有抗腫瘤細胞毒性的靶向-化療藥物偶聯(lián)物,以曲妥珠單抗為靶向分子,以期達到減毒增效的目的[14]。

      在本研究中,我們采用類似于抗體偶聯(lián)藥物(antibody drug conjugate,ADC)的設(shè)計思路,將臨床常用抗HER2 抗體(曲妥珠)與載體材料HFn 偶聯(lián)成靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2,從而增加對HER2 陽性的乳腺癌(HER2+MDA-MB-231-Luci)的腫瘤靶向。結(jié)果表明靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 在體內(nèi)外能更好地靶向HER2 陽性細胞,驗證了臨床常用抗體與HFn 偶聯(lián)的可能性,結(jié)合鐵蛋白藥物載體和抗體高靶向性的優(yōu)勢,可以大大提升鐵蛋白在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      6~8 周齡 SPF 級 BLBC/c 雌性裸鼠(北京維通利華有限公司),實驗過程中對動物的處理符合動物倫理學(xué)標準(許可證編號為LA2018033);標記螢光素酶基因的HER2 陽性及陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231-Luci(本實驗室保存);重鏈鐵蛋白菌種由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙廣華教授提供;大腸桿菌BL21 感受態(tài)(天根生化有限公司);質(zhì)粒小提試劑盒、蛋白 marker、BCA 試劑盒、TEMED(Bio-Rad 公司);DMEM 培養(yǎng)基(上海素爾生物科技有限公司);牛血清白蛋白(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司);青霉素-鏈霉素溶液(100×)(碧云天生物技術(shù));Mal-PEG-NHS(ToYongBio 公司);曲妥珠單抗(國藥準字J20110020);D-熒光素鉀鹽(Thermo Fisher Scientific 公司);其余所用試劑均為分析純。

      AKTA start 蛋白純化儀、Superdex 200 凝膠過濾柱(GE Healthcare 公司);純水儀(Milli-pore 公司);小動物活體成像儀IVIS LuminaⅢ(珀金埃爾默公司);分光光度計Nanodrop2000C(Thermo Sci?entific 公司);馬爾文粒徑分析儀(Malvern Instru?ment 公司);透射電子顯微鏡(日立公司);激光共聚焦顯微鏡(卡爾蔡司公司)。

      1.2 重鏈鐵蛋白誘導(dǎo)表達和鑒定

      將 10 μL 菌液接種到 1 mL 含 100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min 振搖1 h,提取質(zhì)粒,測序。蛋白表達純化過程參照Uchi?da 等的方法[15],但加熱步驟改為在65℃而不是60℃下進行,并使用鎳柱純化。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素的10 mL LB 培養(yǎng)液試管中,37℃、220 r/min 振搖 4~6 h;按 1∶100 接種于含 100 μg/mL 氨芐青霉素的 1 L LB 培養(yǎng)液中,37℃、220 r/min 振搖至菌液D600nm為 0.6~0.8(約 4~6 h);加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L,37℃、220 r/min 振搖過夜,誘導(dǎo)蛋白表達;離心收菌,用PBS 重懸沉淀;重懸液經(jīng)超聲波破碎后,65℃加熱15 min,離心;將上清緩慢加入硫酸銨(濃度約50%),4℃攪拌2 h,4℃冰箱過夜,12 000 r/min 離心10 min,倒掉上清,沉淀復(fù)溶;65℃水浴加熱15 min,離心15 min 收集上清,過0.22 μm 濾膜后,用 30 kD 超濾管超濾 3 次,除硫酸銨,過鎳柱,收集蛋白;30 kD 超濾管超濾,除咪唑并濃縮至2 mL,過Superdex 200 凝膠過濾柱進行尺寸排阻層析;取層析后蛋白進行12% SDSPAGE,考馬斯亮藍染色顯帶。

      1.3 細胞培養(yǎng)

      用DMEM 培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HER2 表達陽性及陰性的乳腺癌細胞HER2+MDA-MB-231-Luci 和HER2-MDA-MB-231-Luci,培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素。

      1.4 靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的制備

      異雙功能交聯(lián)劑馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(Mal-PEG-NHS)用于人重鏈鐵蛋白與抗體的結(jié)合。偶聯(lián)過程如Elisabetta 所述[16]。室溫下取10 mg anti-HER2 與5 mg Mal-PEG-NHS,在 2 mL PBS 溶液(pH7.5)中反應(yīng) 30 min,以30 kD 超濾管超濾除去未反應(yīng)的Mal-PEG-NHS;再將其與人重鏈鐵蛋白在室溫下于PBS 緩沖液(pH7.0)里偶聯(lián) 1 h,30 kD 超濾管超濾 3 次,12 000 r/min 離心 10 min,過 0.22 μm 濾膜,4℃冰箱保存;用Superdex 200 凝膠色譜柱通過尺寸排阻凝膠色譜(SEC)純化復(fù)合后的納米載體;用 PBS 溶液(pH7.4),設(shè)置流速為 1 mL/min,純化樣品以除去游離抗體并收集分離純化后的HFn/anti-HER2。

      1.5 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的表征

      用馬爾文粒徑分析儀進行HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料的尺寸和Zeta 電位分析。樣品用0.22 μm 濾膜過濾,用去離子水稀釋至0.5 mg/mL。粒徑大小分布是通過數(shù)據(jù)分布進行統(tǒng)計的。

      用透射電子顯微鏡分析HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料。用去離子水稀釋至0.5 mg/mL,滴一滴在碳支持膜上,3 min 后用濾紙吸干,再用磷鎢酸染色,2 min 后用濾紙吸干,并干燥,在80 kV的加速電壓下觀察。

      1.6 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的熒光標記

      用Cy5.5-NHS 標記目標蛋白。HFn 及復(fù)合物HFn/anti-HER2 納米靶向材料標記相同量的熒光,蛋白與熒光以1∶2eq 比例標記,避光室溫振蕩反應(yīng)過夜,通過G-25 Sephadex 脫鹽柱去除游離熒光團。本研究用BCA 試劑盒測量蛋白濃度,分光光度計測定熒光標記后的熒光強度。

      1.7 HFn、HFn/anti-HER2納米材料的體內(nèi)外靶向

      將HER2 陽性及陰性的乳腺癌細胞接種在共聚焦皿中,將熒光標記的納米材料加入相應(yīng)的細胞中(Cy5.5 終濃度為200 nmol/L),在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min;用PBS 洗滌細胞3 次,加入DAPI染液(終濃度50 ng/mL)孵育15 min;再用PBS 洗滌細胞2 次,加入100 μL PBS;用激光共聚焦顯微鏡進行熒光顯像。

      根據(jù)批準的方案進行動物實驗,建立HER2陽性乳腺癌荷瘤裸鼠模型,每只鼠肩背部接種5×105HER2 陽性 MDA-MB-231-Luci 細胞,1 周后進行生物發(fā)光成像。尾靜脈注射熒光標記的對照組 HFn-Cy5.5、實驗組 HFn/anti-HER2-Cy5.5 納米材料(Cy5.5 濃度為40 nmol/kg,120 μL),注射后0、2、8、24、48、96、144 h 分別用小動物活體成像儀進行熒光成像,并進行熒光信號統(tǒng)計。

      1.8 統(tǒng)計分析

      用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用x±s表示,2 組間均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 人鐵蛋白重鏈的制備

      鐵蛋白在大腸桿菌中表達,經(jīng)鎳柱純化后進行SDS-PAGE,可見清晰的鐵蛋白亞基條帶(圖1),蛋白帶條帶單一,表明得到的HFn 純度高。

      2.2 人重鏈鐵蛋白與抗HER2抗體的偶聯(lián)

      用雙功能交聯(lián)劑Mal-PEG-NHS 將抗體和重鏈鐵蛋白偶聯(lián)(圖2),獲得的復(fù)合物通過尺寸排阻凝膠色譜表征,以確定交聯(lián)反應(yīng)是否產(chǎn)生預(yù)期的可溶性大分子物質(zhì)。結(jié)果見圖3,HER2 抗體吸收峰位置約在65 mL 處;偶聯(lián)后鐵蛋白吸收峰(55 mL 處)消失,在45 mL 處出現(xiàn)一個新的主峰即為HFn/anti-HER2,表明鐵蛋白與抗HER2 抗體偶聯(lián)成功。用HPLC 進行HER2 抗體的定量分析,計算HFn 綴合物的偶聯(lián)比例,HFn 與HER2 抗體起始摩爾比為1∶3.2,約59%的游離HER2 抗體在65 mL 處洗脫出來,對應(yīng)于HFn,這表明每個HFn連接的HER2 抗體約為1.3 個。

      2.3 靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的表征

      通過透射電子顯微鏡和動態(tài)光散射表征HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2。透射電子顯微鏡顯示HFn(圖4A)為特征性的納米殼-核結(jié)構(gòu),復(fù)合物HFn/anti-HER2(圖4B)仍表現(xiàn)為特征性的納米球形結(jié)構(gòu)。動態(tài)光散射頻率曲線(圖4C)顯示復(fù)合后流體動力學(xué)直徑增加,單獨的HFn的平均直徑為7.11±0.12 nm,而復(fù)合物HFn/anti-HER2的平均直徑為16.88±0.49 nm(表1)。多分散指數(shù)(PDI)表明,和未與HER2 抗體偶聯(lián)的HFn 相比,復(fù)合物HFn/anti-HER2的單分散水平相似(分別為0.18±0.01 vs.0.16±0.03),兩者分散性很好,在水溶液中HFn 與靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的Zeta 電勢分別為-9.82±1.51、-6.59±0.86 mV。

      2.4 復(fù)合物HFn/anti-HER2的體內(nèi)外靶向驗證

      圖1 重鏈鐵蛋白親和純化的SDS-PAGE分析

      圖2 HER2抗體與HFn偶聯(lián)過程模式圖

      為了在體外驗證靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的靶向性,首先進行了體外表征。腫瘤細胞在Cy5.5 通道信號(紅色)(波長設(shè)置為670 nm)結(jié)果顯示,靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 相對于HFn 本身在HER2 陽性乳腺癌細胞中的熒光強度更高(圖5,3~4)。同時,HER2 陽性乳腺癌細胞中較HER2 陰性細胞中熒光強度更高。表明靶向復(fù)合物 HFn/anti-HER2-Cy5.5 增加了 HFn 對 HER2 陽性乳腺癌的靶向性。

      為了進一步驗證靶向復(fù)合物的靶向性,HFn與靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 標記熒光基團Cy5.5之后分別于尾靜脈注入HER2 陽性乳腺癌荷瘤鼠,體內(nèi)熒光成像結(jié)果如圖6所示,可以看出靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2 在24 h 左右出現(xiàn)明顯的腫瘤富集現(xiàn)象,并在48 h 左右達到峰值,之后在96 h 內(nèi)都保持了良好的靶向;對照之下,HFn 在長達144 h 范圍內(nèi)未出現(xiàn)明顯的腫瘤富集現(xiàn)象。此外,熒光強度測量分析(圖7)表明HFn/anti-HER2在體內(nèi)表現(xiàn)出更長的保留時間(24~72 h)。

      圖3 HFn、游離HER2抗體及靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的尺寸排阻凝膠色譜曲線

      圖4 HFn(A)和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2(B)的透射電子顯微鏡圖像(比例尺:100 nm);C為通過動態(tài)光散射獲得的HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的頻率曲線

      表1 HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2的直徑、多分散指數(shù)(PDI)及Zeta電勢(x±s,n=3)

      圖5 細胞熒光實驗檢測HFn及靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2對乳腺癌細胞的腫瘤靶向性

      3 討論

      納米材料靶向成像及載藥是近年來的研究熱點,其可通過增強滲透滯留(enhanced permea?bility and retention,EPR)效應(yīng)及與主動靶向方式靶向腫瘤[17-18]。鐵蛋白作為一種生物納米材料具有良好的生物相容性,無免疫原性,并且其內(nèi)部空腔可以作為藥物載體裝置,因此在腫瘤的診斷與治療方面展現(xiàn)了優(yōu)勢[19-20]。作為備受關(guān)注的天然藥物載體,如何對鐵蛋白進行修飾以提高其靶向性,一直是研究的熱點。目前提高其靶向性主要通過靶向修飾配體、抗體,但未將其與臨床常用靶向治療分子連用。目前單克隆抗體的靶向性和特異性受到研究者青睞[21],因此,利用抗體結(jié)合提升鐵蛋白的靶向性是適當可行的思路。HER2 是HER2 陽性乳腺癌靶向治療的關(guān)鍵靶點,作為模型抗體具有很高的研究和臨床價值。

      圖6 HER2陽性乳腺癌荷瘤鼠的腫瘤靶向性成像

      圖7 HFn和靶向復(fù)合物HFn/anti-HER2在HER2陽性乳腺癌荷瘤鼠模型中的熒光強度分析

      我們利用HER2 抗體對腫瘤的高靶向特性,將人重鏈鐵蛋白作為藥物或試劑載體與之相連,發(fā)揮HER2 抗體的良好腫瘤靶向性及鐵蛋白的載體特性,構(gòu)建一個靶向復(fù)合物納米載體平臺。本研究探討了人重鏈鐵蛋白與臨床常用HER2 抗體連用的可能性,人重鏈鐵蛋白可以與HER2 抗體以1∶1.3的比例連接,在體內(nèi)靶向腫瘤成像時,成像平均熒光強度在48 h 達到最強,靶向性是重鏈鐵蛋白本身的3 倍,說明鐵蛋白的靶向性增加,有利于將其進行臨床轉(zhuǎn)化,具有研究價值和開發(fā)潛能。有文獻報道,修飾后的鐵蛋白可以裝載更多的化療藥物或成像分子,且擁有較長的循環(huán)半衰期,故能更好地用于腫瘤的治療[8]。本研究運用熒光標記檢測,在體內(nèi)外觀察到良好的靶向性,關(guān)于載藥后成像及治療還在進一步研究中。

      綜上,我們構(gòu)建了人重鏈鐵蛋白-抗體偶聯(lián)物,人重鏈鐵蛋白作為藥物載體,臨床常用抗體作為靶向分子,極大地提升了鐵蛋白的腫瘤靶向性,增強了鐵蛋白在腫瘤診斷和治療方面的潛力,為后續(xù)鐵蛋白的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行思路。

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