周雨露，林泓，張大兵,2，王燦華，余婧

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酮類物質(zhì)合成酶OsPKS1和OsPKS2對水稻花粉外壁形成的作用

周雨露1，林泓1，張大兵1,2，王燦華1，余婧1

（1上海交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2阿德萊德大學(xué)農(nóng)業(yè)食品和葡萄酒學(xué)院，澳大利亞 SA 5005）

【背景】植物花粉外圍包裹的花粉外壁作為植物雄性配子的天然保護(hù)屏障對植物的生殖發(fā)育起到非常重要的作用。植物花粉外壁的主要成分是孢粉素，主要由脂類物質(zhì)和酚類物質(zhì)構(gòu)成。因此，脂類物質(zhì)和酚類物質(zhì)的代謝是植物花藥內(nèi)外壁形成和花粉外壁形成的關(guān)鍵步驟。在其合成過程中，PKS1/PKSA/LAP6和PKS2/PKSB/LAP5在不同物種間發(fā)揮保守的生化功能?！灸康摹客ㄟ^研究水稻和在花藥內(nèi)外壁和花粉外壁發(fā)育過程中的作用，為水稻花藥內(nèi)外壁和花粉外壁合成機(jī)理提供新認(rèn)識?！痉椒ā克净ㄋ幇l(fā)育基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)AntherNet預(yù)測到一個(gè)可能參與孢粉素合成的基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在野生型9522背景和突變體背景下敲除獲得單突變體和雙突變體。在同一生長條件下比較野生型和突變體植株表型，分析突變體植株的營養(yǎng)生長和花器官發(fā)育情況。通過I2-KI染色分析和的花粉活力。通過半薄切片觀察野生型和突變體各個(gè)時(shí)期花藥四層細(xì)胞發(fā)育及小孢子發(fā)育，利用掃描電子顯微鏡觀察野生型和突變體花藥外壁、花藥內(nèi)壁和花粉外壁表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)，利用透射電子顯微鏡觀察野生型和突變體花藥壁細(xì)胞、花粉外壁和烏氏體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。【結(jié)果】獲得4個(gè)單突變體和4個(gè)雙突變體，其中，是純合的單突變體，是純合的雙突變體。和均呈現(xiàn)雄性不育的表型。與的花粉外壁和烏氏體結(jié)構(gòu)均不正常，但兩者結(jié)構(gòu)不同?；ㄋ幈砻婵尚纬赏蛊鸬耐獗诮Y(jié)構(gòu)；絨氈層可正常降解?；ǚ弁獗趦?nèi)部形成大量微小的空洞，柱狀體變短，無法有效連接覆蓋層和花粉外壁內(nèi)層；烏氏體的底部結(jié)構(gòu)減小，頂部結(jié)構(gòu)增多，并且較野生型更為尖銳。花藥外壁角質(zhì)層減少；絨氈層無法正常降解。小孢子表面無花粉外壁，在11期降解；烏氏體在9期形態(tài)異常，數(shù)目變少，到11期從絨氈層脫落?！窘Y(jié)論】//和//的功能在多個(gè)物種間均保守，可以影響孢粉素的合成和堆積。但在水稻中兩者對于花粉外壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)身碎骨和烏式體形成的功能不同：對柱狀層的形成以及烏氏體的底部結(jié)構(gòu)形成更為重要；而對于覆蓋層的形成以及烏氏體的頂部結(jié)構(gòu)更為重要。兩者互相補(bǔ)充，共同調(diào)控花粉外壁、花藥外壁的形成和絨氈層的降解。

水稻；OsPKS1；OsPKS2；孢粉素；花粉外壁；雄性不育

0 引言

【研究意義】稻米是人類最主要的糧食來源，中國是世界上水稻種植和消費(fèi)大國，不僅有著悠久的水稻栽培歷史，還擁有先進(jìn)水稻育種技術(shù)體系，特別是雜交水稻育種技術(shù)的應(yīng)用和推廣，大大緩解了中國乃至全世界的糧食安全問題。雜交水稻育種依賴于雄性不育作為母本獲取F1代種子，因此，雄性不育系的鑒定和分析對于雜交水稻育種具有重要意義[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻雄性發(fā)育是在花藥這個(gè)生殖器官中完成，花藥原基經(jīng)歷一系列細(xì)胞分裂分化，形成自外向內(nèi)分別是表皮、內(nèi)皮層、中間層和絨氈層的四層壁細(xì)胞，四層壁細(xì)胞包裹的孢母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成小孢子。此時(shí)，絨氈層細(xì)胞合成孢粉素，運(yùn)輸?shù)叫℃咦颖砻?，形成花粉外壁[2]。花粉外壁可以保護(hù)花粉免受外界各種生物及非生物的傷害，例如紫外線、高溫以及病蟲害等[3-5]，花粉外壁對于物種的識別也有著重要作用[6]。花粉外壁主要包括2部分結(jié)構(gòu)，從里到外分別是花粉外壁內(nèi)層和花粉外壁外層，外壁外層包括最外部的覆蓋層和柱狀體[7-8]。研究表明孢粉素是由脂類物質(zhì)和酚類物質(zhì)及其衍生物組成的高分子聚合物[9-11]。研究證實(shí)大量的脂類代謝相關(guān)基因參與孢粉素的形成，水稻中花藥特異表達(dá)基因[12]和[13]，其編碼蛋白參與脂肪酸羥基化，形成ω-羥基脂肪酸和鏈內(nèi)羥基脂肪酸。在擬南芥中，[14]與功能保守，[15]與功能保守。水稻（）[16]和擬南芥（）[17]編碼一類脂肪酸還原酶，能夠?qū)⒆貦磅；d體蛋白轉(zhuǎn)化為1-十六烷醇，也可催化十八碳?；d體蛋白，將其轉(zhuǎn)化為十八烷醇。（）[18]編碼一個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的?；D(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒘u基肉桂酰輔酶A的?；D(zhuǎn)移到ω-羥基脂肪酸上。OsNP1（No POLLEN1）[19]是一個(gè)葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶成員，主要在絨氈層中表達(dá)，該基因的缺失使得環(huán)氧衍生的比例明顯下降，暗示OsNP1參與脂肪酸的環(huán)氧修飾。以上基因的缺失都會導(dǎo)致花粉外壁形成缺陷，從而影響育性。此外，研究發(fā)現(xiàn)一條在擬南芥、水稻、煙草、油菜等植物中保守的關(guān)于孢粉素酚類物質(zhì)的代謝途徑[20-24]。在擬南芥中，孢粉素合成所需的中長鏈脂肪酸由ACOS5（CoA Synthetase5）催化成中長鏈脂肪酰-CoA[25],中長鏈脂肪酰-CoA經(jīng)PKS1/PKSA/LAP6（POLYKETIDE SYNTHASE 1/POLYKETIDESYNTHASE A/LESS ADHESIVE POLLEN 6）和PKS2/PKSB/LAP5（POLYKETIDE SYNTHASE 2/ POLYKETIDE SYNTHASE B/LESS ADHESIVE POLLEN 5）催化與丙二酰輔酶A縮合形成三酮或四酮的α-吡喃酮[26-27]，后可被DRL1/TKPR1（DIHYDROFLAVONOL 4-REDUCTASE-LIKE 1/ TETRAKETIDE α-PYRONE REDUCTASE1）和DRL2/TKPR2（DIHYDROFLAVONOL 4-REDUCTASE- LIKE 2/TETRAKETIDE α-PYRONE REDUCTASE2）所還原[28]。的水稻同源基因（）在水稻中也行使保守的功能，突變體也表現(xiàn)出與擬南芥相似的雄性不育的表型，并且會影響花藥外壁、烏式體和花粉外壁的形成[21,25]。和的水稻同源基因和屬于植物PKSⅢ超家族，該家族蛋白催化多種植物次生代謝產(chǎn)物的合成。在植物從水生走向陸生進(jìn)化過程中起到非常重要的作用[26]。而花粉外壁的形成被認(rèn)為是植物從水生走向陸生的重要原因[6]。研究表明這兩個(gè)基因可能存在保守的生物學(xué)功能，參與吡喃酮相關(guān)的孢粉素合成[20-24]。體外生化試驗(yàn)表明OsPKS1和OsPKS2可將飽和或者不飽和的16C或者18C脂肪酰-CoA與丙二酰輔酶A縮合形成三酮或四酮的α-吡喃酮從而控制花粉發(fā)育[24-29]。此外，用擬南芥和啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)水稻和cDNA序列可以基本恢復(fù)和/的花粉外壁缺陷[29-30]。以上結(jié)果說明PKSs在水稻和擬南芥中功能保守，但細(xì)胞學(xué)研究及代謝分析研究發(fā)現(xiàn)PKSs在水稻和擬南芥功能存在差異。擬南芥和的花粉外壁花紋異常，但育性不受影響。代謝測定顯示或突變體中代謝物總量變化不明顯，而雙突變體的代謝物大大下降[27,31]，說明可能存在功能冗余，共同參與孢粉素合成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】擬南芥和的花粉外壁形態(tài)異常[27,31],它們的花粉外壁與野生型相比更薄，柱狀體更短，但花粉可育。水稻的同源突變體和均呈現(xiàn)雄性不育的表型，花粉外壁堆積了更多的孢粉素顆粒，脂類物質(zhì)積累稍有上升[29-30,32]。以上結(jié)果說明PKS1/PKSA/LAP6和OsPKS1/OsLAP6以及PKS2/PKSB/LAP5和OsPKS2/ OsLAP5雖然具有保守的生化功能，其細(xì)胞學(xué)功能尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用CRISPR/ Cas9技術(shù)分別在野生型和突變體背景下敲除獲得單突變體和雙突變體，通過半薄切片,掃描電鏡和透射電鏡等技術(shù)觀察突變體表型，分析在水稻花藥發(fā)育中的細(xì)胞學(xué)功能，研究和兩者協(xié)同調(diào)控花粉外壁的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型水稻品種為武運(yùn)粳7號（9522），該品種于2018年夏季種植在上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)基因科普教育基地，春季種植于海南三亞上海南繁站試驗(yàn)田。

1.2 菌株和載體

1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ均購自NEB公司，T7連接酶購自TaKaRa公司，DNA聚合酶購自上海申能博彩有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen；卡那霉素（Kanamycin）和氨芐青霉素（Ampicillin）購自上海先鋒藥業(yè)有限公司；DNA測序服務(wù)由上海華大基因公司提供；乙醇、甲醛、戊二醛、異丙醇等常規(guī)試劑均購自國藥集團(tuán)(上海)有限公司。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.4 CRISPR-Cas9重組載體構(gòu)建、水稻轉(zhuǎn)化及突變體鑒定

通過基因分析網(wǎng)站（http://gramene.org）確定基因外顯子，使用蛋白分析網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg. de）預(yù)測基因保守區(qū)域，在CRISPR-P 2.0（http:// crsripr.hzau.cn/CRISPR2）網(wǎng)站輸入保守區(qū)域序列信息來尋找符合條件的靶標(biāo)，根據(jù)CRISPR-Cas9原理在PAM序列（protospacer adjacent motif-NGG）上游20個(gè)堿基處設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，正向引物選取第9—20位堿基作為主體并在兩端加上接頭，反向引物選取第1—12位堿基作為主體，在兩端加上接頭。選取2個(gè)靶點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物，具體引物序列（表1）。通過文獻(xiàn)[33]中描述方法，利用通用引物和設(shè)計(jì)引物OsPKS1-T1和OsPKS1-T2構(gòu)建CRISPR/Cas9質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中，再將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到野生型水稻愈傷組織來獲得單突變體；轉(zhuǎn)入愈傷組織獲得雙突變體。轉(zhuǎn)基因植株通過PCR產(chǎn)物測序方法鑒定基因型，引物信息見表1。

1.5 ospks1和ospks1 ospks2突變體表型分析

用Nikon E995數(shù)碼相機(jī)拍攝突變體整株和花器官表型。通過碘染劑測定花粉活力，野生型和突變體花粉用醫(yī)用鑷子輕夾使之釋放到I2-KI溶液中（0.2%碘和2%碘化鉀），顯微鏡（Leica DM2500）拍照并記錄可育花粉比例。半薄切片觀察花藥表型采用李娜等[34]方法制備8b—12期的花藥，根據(jù)張大兵等[35-36]方法確定花藥發(fā)育時(shí)期。

將野生型和突變體花藥用4%戊二醛溶液固定，然后在0.2 mol·L-1，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液中漂洗3次，然后在2%OsO4溶液中后固定4 h以上。經(jīng)過酒精梯度脫水和環(huán)氧丙烷置換，樣品最終被包埋進(jìn)丙烯酸樹脂中（London Resin Company, London, UK）。然后通過超薄切片（70 nm, using an Ultramicrotome Leica EM UC7），并用2%乙酸鈾酰和2.6%檸檬酸鉛雙重染色，最后用120 kV TEM進(jìn)行拍照和記錄（FEI, Tecnai G2 Spirit Bio TWIN）。

將野生型和突變體13期花藥用FAA溶液固定2h以上。使用梯度酒精對材料進(jìn)行脫水處理，依次加入70%、80%、95%和100%乙醇，脫水后使用臨界點(diǎn)干燥器（Critical Point Drier, Leica EM CPD300, Germany）干燥花藥樣品。在銅臺上貼上導(dǎo)電膠，將花藥樣品放置在導(dǎo)電膠上。將銅臺放入鍍膜機(jī)（Super Cool Sputter Coater, Leica SCD050, Germany）中進(jìn)行噴金處理。掃描電鏡（Scanning Electron Microscope, Hitachi S-4800, Japan）下觀察樣品的花藥內(nèi)外壁和花粉外壁的形態(tài)并拍照記錄。

表1 OsPKS1 CRISPR構(gòu)建引物及鑒定引物

2 結(jié)果

2.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得ospks1單突變體和ospks1 ospks2雙突變體

從水稻花藥發(fā)育網(wǎng)絡(luò)AntherNet[37]預(yù)測到一個(gè)可能參與孢粉素合成的基因，結(jié)果表明，該基因是一個(gè)在絨氈層中特異表達(dá)的基因[30,32]。為了驗(yàn)證對孢粉素合成的作用以及和在水稻花藥發(fā)育過程中的作用，在的第二個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了2個(gè)位點(diǎn)(圖1-A),利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得9522背景下的單突變體和背景下的雙突變體來驗(yàn)證其基因功能。從獲得的大量轉(zhuǎn)基因苗中，分別選取8棵材料進(jìn)行鑒定，獲得4個(gè)單突變體和4個(gè)雙突變體（圖1-B和圖1-D），其中一個(gè)單突變體在+1 322 bp缺失一個(gè)堿基T，從 +1 398 bp開始缺失4 bp，命名為；一個(gè)雙突變體在從+1 319 bp缺失2個(gè)堿基，從+1 398 bp開始缺失5 bp，命名為(圖1-B)。蛋白結(jié)構(gòu)分析突變體的突變都發(fā)生在保守結(jié)構(gòu)域上(圖1-C)，并且造成翻譯提前終止。以上結(jié)果說明成功獲得敲除的突變體。

2.2 突變體ospks1-3和ospks1-4 ospks2植株育性表型

通過對獲得的突變體進(jìn)行表型分析。與野生型相比，和表現(xiàn)為正常的營養(yǎng)生長和花器官發(fā)育（圖2-A—圖2-E），和的穗型與野生型相比也無明顯差異（圖2-B），但是單突變體和雙突變體的花藥比野生型小(圖2-F—圖2-H)，特別是雙突變體，它的花藥顏色偏白。I2-KI染色結(jié)果顯示單突變體的花粉失去活力，而雙突變體不能形成成熟的花粉（圖2-F—圖2-H），而與相似，也能形成失去活力的花粉[29]。根據(jù)以上結(jié)果以及之前的研究[29-30,32]表明和協(xié)同控制水稻花粉發(fā)育。

A：2個(gè)靶點(diǎn)在OsPKS1中的位置及2個(gè)靶點(diǎn)gRNA表達(dá)盒與pRGEB32CRISPR/Cas9組裝成的表達(dá)載體；B：ospks1-3和ospks1-4 ospks2突變體的突變位點(diǎn)測序結(jié)果；C：野生型與突變體表達(dá)蛋白分析，色框顯示的是預(yù)測出的保守域，箭頭表示突變位置。D：其他等位的基因型信息

A：野生型植株（左）、ospks1-3突變體植株（中間）和ospks1-4 ospks2突變體植株（右）；B：結(jié)實(shí)階段野生型穗型（左）、ospks1-3突變體穗型（中間）和ospks1-4 ospks2突變體穗型（右）；C—E：分別是去掉內(nèi)外稃的13期野生型小花、ospks1-3小花和ospks1-4 ospks2小花；F：野生型黃色花藥，13期被I2-KI溶液染色的花粉；G：ospks1-3花藥，13期被I2-KI溶液染色的花粉；G：ospks1-4 ospks2花藥，13期被I2-KI溶液染色的花粉。Pi：雌蕊；St：雄蕊。Bar：10 cm(A)；5 cm(B)；2 mm(C—E)；1 mm(F—H)；200 μm(F—H)內(nèi)部

A—E：野生型；F—J：ospks1-3突變體；K—O：ospks1-4 ospks2突變體。DMsp：退化的小孢子；E：表皮；En：內(nèi)皮；Ml：中間層；Msp：小孢子；T：絨氈層；Tds：四分體；Mp：成熟的花粉；DMp：退化的成熟花粉。Bar:20 μm(A—O)

2.3 半薄切片觀察ospks1-3和ospks1-4 ospks2的花藥發(fā)育過程

通過對突變體進(jìn)行I2-KI溶液染色，結(jié)果表明，突變體產(chǎn)生的花粉缺乏活力，不能產(chǎn)生花粉，需要進(jìn)一步研究突變體與野生型花粉發(fā)育的形態(tài)差異過程。分別以突變體和突變體作為研究材料，進(jìn)行花藥的橫斷面分析，比較突變體與野生型花粉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期形態(tài)差異[34]。結(jié)果顯示，突變體在花藥發(fā)育8b期至11期（圖3-F—圖3-I）與野生型（圖3-A—圖3-D）相比無明顯差異，表現(xiàn)出正常的小孢子發(fā)育和絨氈層降解。野生型在12期積累淀粉，形成圓形的成熟花粉（圖3-E），而突變體在12期（圖3-J）小孢子形態(tài)異常并皺縮。突變體在花藥發(fā)育8b期至9期（圖3-K—圖3-L）與野生型（圖3-A—圖3-B）相比無明顯差異，表現(xiàn)出正常的四分體發(fā)育和絨氈層波浪狀形態(tài)。10期野生型（圖3-C）小孢子呈圓形并且空泡化，而突變體在10期（圖3-M）小孢子無法形成空泡化并在小孢子外圍形成透明未知物質(zhì)，絨氈層異常膨大無法正常降解。11期野生型（圖3-D）絨氈層進(jìn)一步降解，而突變體在11期（圖3-N）絨氈層依然呈現(xiàn)異常膨大狀態(tài)，并且小孢子形態(tài)異常，被部分降解，并在12期（圖3-O）小孢子被完全降解。結(jié)合[29]結(jié)果和花藥發(fā)育的半薄切片結(jié)果，表明或的突變不影響小孢子在10期的空泡化，影響其后期發(fā)育，不影響絨氈層發(fā)育。而當(dāng)和同時(shí)缺失時(shí)將導(dǎo)致小孢子外壁不能正常形成，10期小孢子無法進(jìn)行空泡化并且提前降解；絨氈層異常膨大，無法正常降解。

2.4 掃描電鏡及透射電鏡觀察ospks1-3花藥和花粉精細(xì)結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步研究突變體花粉發(fā)育缺陷，對13期野生型和突變體的花藥和花粉利用掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)行觀察。掃描電鏡結(jié)果顯示野生型花粉呈現(xiàn)圓形（圖4-A），而突變體呈現(xiàn)扁形形態(tài)（圖4-E）。野生型（圖4-B）和突變體（圖4-F）花藥外壁無明顯差異。13期野生型的花粉外壁呈現(xiàn)均勻分布的點(diǎn)簇狀規(guī)則結(jié)構(gòu)（圖4-C），而突變體（圖4-G）無法形成這一結(jié)構(gòu)。野生型烏式體大小較均勻且大致呈現(xiàn)均勻分布（圖4-D），突變體烏式體形態(tài)異常且分布較不規(guī)則（圖4-H）。

A—H：13期野生型和ospks1-3突變體花藥和花粉表面的掃描電鏡分析；I—L：10期野生型和ospks1-3突變體烏式體和花粉外壁的透射電鏡分析。A：野生型花粉；B：野生型花藥外壁；C：野生型花粉外壁；D：野生型花藥內(nèi)壁；E：ospks1-3突變體花粉；F：ospks1-3突變體花藥外壁；G：ospks1-3突變體花粉外壁；H：ospks1-3突變體花藥內(nèi)壁；I：野生型花粉外壁；J：ospks1-3突變體花粉外壁；K：野生型烏式體；L：ospks1-3突變體烏式體。Ex：花粉外壁；DEx：畸形花粉外壁；Ne：外壁內(nèi)層；Ub：烏式體；Ba：柱狀體；Te：覆蓋層。Bars：20 μm(A、E)；10 μm(B、F)；1 μm(C、D、G、H)；0.5 μm (I—L)

透射電鏡結(jié)果顯示，在花粉發(fā)育10期，野生型（圖4-I）形成規(guī)則的兩層花粉外壁結(jié)構(gòu)，圓錐形物質(zhì)在頂蓋上呈規(guī)律的間隔分布，雖然突變體（圖4-J）也能形成兩層的花粉外壁結(jié)構(gòu)，但是花粉外壁內(nèi)部可見大量微小的空洞，結(jié)構(gòu)更為松散，柱狀體變短，無法有效連接覆蓋層和花粉外壁內(nèi)層。這與花粉外壁增厚，孢粉素顆粒變大的表型不盡相同[29]。野生型烏式體在花藥內(nèi)壁上呈現(xiàn)均勻分布(圖4-K)，而突變體烏式體（圖4-L）下部中部無染色的部分高度減小，而上層染色的部分更厚，并可見更多數(shù)目的尖銳突起，甚至有些烏式體缺乏下部結(jié)構(gòu)，只有更厚的上層結(jié)構(gòu)。這與烏氏體的下層結(jié)構(gòu)高度增加，上層結(jié)構(gòu)突起更圓潤的表型正好相反[29]。以上結(jié)果暗示影響花粉外壁和烏式體正常結(jié)構(gòu)的形成，這可能影響孢粉素在花粉表面的堆積，從而影響花粉的發(fā)育，并且與的功能存在差異。

2.5 掃描電鏡及透射電鏡觀察ospks1-4 ospks2花藥內(nèi)外壁和花粉外壁精細(xì)結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步研究突變體花粉發(fā)育缺陷，同樣對13期野生型和突變體的花藥和花粉利用掃描電鏡進(jìn)行觀察。和半薄切片結(jié)果一致（圖3-O），13期突變體花藥腔內(nèi)無小孢子。野生型在花藥發(fā)育13期形成正常的泡面狀縱橫交錯(cuò)的花藥外壁（圖5-A）以及分布均勻的烏式體（圖5-B），而突變體（圖5-C）的花藥外壁形態(tài)異常，與野生型相比表面較為光滑，紋路變少，并且在花藥內(nèi)壁無法形成烏式體（圖5-D）。以上結(jié)果說明和功能保守，共同調(diào)控水稻花藥外壁和烏式體的發(fā)育。

A：野生型花藥外壁；B：野生型花藥內(nèi)壁；C：ospks1-4 ospks2突變體花藥外壁；D：ospks1-4 ospks2突變體花藥內(nèi)壁。Ub：烏式體。Bars：10 μm(A、C)；1 μm(B、D)

為了進(jìn)一步研究突變體花粉外壁和烏式體形成缺陷，利用透射電鏡觀察9—11期野生型和突變體花藥的精細(xì)結(jié)構(gòu)。在花藥發(fā)育9期，野生型（圖6-A）小孢子表面形成外壁內(nèi)層和柱狀體結(jié)構(gòu)，且它的烏式體（圖6-G）形態(tài)呈圓形透明狀，但是（圖6-D）花粉外壁內(nèi)層結(jié)構(gòu)異常，柱狀體前體變小，且中烏式體（圖6-J）形態(tài)異常并形成較多頂部物質(zhì)；在花藥發(fā)育10期，野生型（圖6-B）形成典型的由外壁內(nèi)層和外壁外層構(gòu)成的花粉外壁結(jié)構(gòu)，絨氈層表面（圖6-H），烏式體呈底部透明近似圓狀，頂部被染色較深，但是（圖6-E）在這個(gè)時(shí)期無法觀察到明顯的花粉外壁，孢粉素?zé)o法在小孢子表面進(jìn)行堆積，且（圖6-K）烏式體形態(tài)異常，未黏附在絨氈層上；在花藥發(fā)育11期，野生型（圖6-C）呈現(xiàn)出典型的兩層花粉外壁結(jié)構(gòu)，野生型（圖6-I）絨氈層表面，烏式體與10期形態(tài)相似（圖6-H），但是（圖6-F）在這個(gè)時(shí)期無法觀察到花粉外壁，并且小孢子細(xì)胞膜斷裂（如白色箭頭指示），這與橫斷面表型分析結(jié)果小孢子被降解一致（圖3-N），這個(gè)時(shí)期中的（圖6-L）烏式體形態(tài)異常并且皺縮，且從絨氈層上脫離。綜合上述結(jié)果和之前研究表明最終無法形成烏式體和花粉外壁，而（圖4-J，圖4-L）和[29]單突變形成異常的花粉外壁和烏式體。

A—C：野生型9—11期花粉外壁；D—F：ospks1-4 ospks2突變體9—11期花粉外壁；G—I：野生型9—11期烏式體；J—L：ospks1-4 ospks2突變體9—11期烏式體。Msp：小孢子；DMsp：退化的小孢子；AEx：異常的花粉外壁；Ne：外壁內(nèi)層；Ub：烏式體；T：絨氈層；Ba：柱狀體；Te：覆蓋層；Pb：柱狀體前體；Pe：外壁外層前體。Bars：0.5 μm

3 討論

3.1 PKSs對水稻育性的影響

孢粉素作為花粉表面的主要成分，其正常的合成和堆積方式對于花粉活力，花粉育性以及物種識別都是至關(guān)重要的，孢粉素主要由脂肪酸及其衍生物和酚類物質(zhì)及其衍生物組成，因此，這兩大類物質(zhì)的體內(nèi)合成途徑對于孢粉素合成是至關(guān)重要的[24]。其中脂肪酸及其衍生物因易于測定以及獲得了較多數(shù)目的合成酶編碼基因，其合成途徑已被研究得較為深入，然而對于酚類衍生物合成途徑的研究還主要依賴于少數(shù)已知的酶的遺傳學(xué)和體外的生化功能研究。目前，在擬南芥、水稻、煙草等多個(gè)物種中均鑒定了一條保守的生化途徑，參與合成由羰基連接長鏈脂肪酸鏈和苯環(huán)的酚類物衍生物——α-吡喃酮[20-24]。本研究從水稻花藥發(fā)育網(wǎng)絡(luò)AntherNet[37]預(yù)測到一個(gè)參與孢粉素合成的關(guān)鍵基因，它和水稻中另一個(gè)PKS成員基因，編碼的蛋白結(jié)構(gòu)類似，具有相同的體外催化活性[24,29]，本研究結(jié)果（圖3-J）及前人研究[29-30,32]顯示，水稻的和花粉外壁異常，無法正常形成花粉。本研究通過對的半薄切片觀察顯示，雙突變體無法形成花粉外壁，小孢子在11期即被降解（圖3-O）。擬南芥的//和//花粉外壁異常，但均可形成可育花粉，雙突變體幾乎無花粉外壁堆積并且雄性不育[27]。而水稻的和單突變體均呈現(xiàn)雄性不育，說明和對于水稻花粉育性是更必要的，可能由于水稻的花粉外壁形態(tài)對其花粉育性較擬南芥具有更重要的作用，因此PKSs對水稻花藥育性的影響較擬南芥更為強(qiáng)烈。

3.2 PKSs在水稻和擬南芥中的保守性和差異性

在孢粉素合成過程中，脂肪酸經(jīng)ACOS合成脂肪酰輔酶A，而后在PKSs聚酮合酶作用下合成聚酮化合物，隨后在黃酮醇還原酶TKPRs作用下將羰基還原成羥基[24,27,29]。說明PKSs具有保守的酶活性。用擬南芥和啟動(dòng)水稻和序列可以基本恢復(fù)和/的花粉外壁缺陷[29-30]。進(jìn)一步說明PKSs在水稻和擬南芥中功能保守。在擬南芥中，/和/都會影響擬南芥花粉外壁的結(jié)構(gòu)，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示兩者花藥的代謝物含量與野生型相比差異較微弱，而雙突變體則完全無法形成花粉外壁，花藥代謝物大大下降，暗示兩者可能功能互補(bǔ)，共同參與花粉外壁發(fā)育[27,31]。擬南芥//突變體缺乏網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，影響了覆蓋層的形成；//突變體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙減小，可能是下部的柱狀體受到影響[27,31]。而在水稻中，覆蓋層異常更為顯著；而與前人的報(bào)道一致，花粉外壁的柱狀體變短（圖4-J），以上結(jié)果說明、的表型與//、//的表型相對比較保守，都是部分地影響了花粉外壁的結(jié)構(gòu)，并且兩者影響的結(jié)構(gòu)互有差異，暗示和對花粉外壁花紋的調(diào)控作用略有差異，這與擬南芥的//和//功能保守。另外，通過掃描電鏡和透射電鏡均發(fā)現(xiàn)，的花粉外壁內(nèi)部出現(xiàn)細(xì)小空洞（圖4-J，圖4-G），說明亦調(diào)節(jié)花粉外壁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這在前人的研究中均未有報(bào)道[30,32]。

另一方面，對水稻突變體烏式體的觀察結(jié)果（圖4-L）和前人的研究[29-30,32]表明，和都會影響烏式體的正常發(fā)育，的烏式體底部結(jié)構(gòu)增大，表面的突起更為圓潤，而的烏式體底部結(jié)構(gòu)減小，表面的突起更為尖銳，暗示兩者在調(diào)節(jié)烏式體形態(tài)上功能并不互補(bǔ)，更趨向于呈現(xiàn)相反的功能。而雙突變體（圖6-J—圖6-L）烏式體的底部結(jié)構(gòu)和頂部結(jié)構(gòu)都大大減小，烏式體形態(tài)異常明顯，進(jìn)一步支持和兩者差異地調(diào)控烏式體的形態(tài)發(fā)育。本研究利用烏式體這一擬南芥沒有的結(jié)構(gòu)，更進(jìn)一步闡釋了和在控制孢粉素合成和沉積的功能差異。根據(jù)以上結(jié)果可以推測和共同參與到花粉外壁和烏式體的形成，但是兩者的功能既保守又有差異。雖然這兩個(gè)基因生化功能保守，其功能差異可能是因?yàn)閮烧邔Φ孜锞哂胁煌钠眯?。根?jù)以上結(jié)果得出OsPKS1和OsPKS2在花藥外壁和花粉外壁發(fā)育過程中作用的可能模式圖（圖7），OsPKS1和OsPKS2催化經(jīng)由OsACOS12催化產(chǎn)生的底物脂肪酰輔酶形成帶有不同類型的聚酮化合物，不同類型的聚酮化合物分別參與烏氏體和花粉外壁不同結(jié)構(gòu)的形成，而聚酮化合物也參與花藥外壁的發(fā)育。

Polyketide：聚酮化合物；Cutin Monomers：角質(zhì)單體；Sporopollenin Precursor：孢粉素前體；Anther Cuticle：花藥角質(zhì)層；Pollen wall：花粉外壁。OsACOS12催化不同的脂肪酸形成脂肪酰輔酶A，形成的脂肪酰輔酶A繼續(xù)被OsPKS1或OsPKS2催化形成不同類型的聚酮化合物，不同類型的聚酮化合物分別參與角質(zhì)單體和孢粉素前體的形成，繼而參與烏氏體和花粉外壁不同結(jié)構(gòu)的形成，聚酮化合物也參與花藥角質(zhì)層的發(fā)育

3.3 OsPKS1和OsPKS2對絨氈層程序化死亡的影響

很多研究顯示脂類合成和修飾相關(guān)基因的缺失都會影響絨氈層的正常降解，比如缺失水稻中脂類相關(guān)基因（）[38]、[12]、[16]、[19]以及[21]都會影響絨氈層降解。本研究觀察到絨氈層異常膨大不能正常降解的現(xiàn)象，而在（圖4-F—圖4-J）和[29]中絨氈層降解未見異常。絨氈層也異常膨大，最終花藥腔的物質(zhì)幾乎完全被降解，但是缺陷更為嚴(yán)重，它無法形成花藥外壁表面的花紋以及完成無法形成烏式體[21]。這從遺傳學(xué)角度為、和參與同一代謝途徑提供了證據(jù)，并可以推測可能通過其他基因參與花藥外壁形成及烏式體形成。

根據(jù)雙突變體絨氈層異常而單突變體絨氈層降解正常的結(jié)果，以及和的烏式體和花粉外壁表型差異的結(jié)果推測，OsPKS1和OsPKS2可能催化經(jīng)由OsACOS12催化產(chǎn)生的底物脂肪酰輔酶A，但是兩者可能對于不同類型的脂肪酰輔酶A偏好性略有差異。OsPKS1和OsPKS2兩者協(xié)同作用，極大程度地催化了脂肪酰輔酶A，形成聚酮化合物。而脂肪酰輔酶A的過度積累或者聚酮化合物的降低，影響了絨氈層細(xì)胞內(nèi)的脂類物質(zhì)和/或酚類物質(zhì)代謝，影響絨氈層降解。

對于和如何共同參與到烏式體形成和絨氈層降解需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究，后續(xù)可以通過、、和的代謝產(chǎn)物分析進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

OsPKS1和OsPKS2均參與花粉外壁和花藥外壁的發(fā)育，兩者具有保守的生化功能但兩者功能存在差異。對柱狀體和烏氏體的底部結(jié)構(gòu)影響更大，而對覆蓋層和烏氏體的頂部結(jié)構(gòu)影響更大；影響花粉外壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)的組裝，目前尚未發(fā)現(xiàn)的此功能。這可能是由于兩者存在不同的底物偏好性，而其產(chǎn)物的差別決定了其生物學(xué)功能的差異。和兩者共同調(diào)控花藥外壁和絨氈層降解。

致謝：李煥軍給予超薄切片實(shí)驗(yàn)技術(shù)的指導(dǎo)；陳明姣師傅和陳曉菲給予愈傷組織培養(yǎng)以及水稻材料的種植的指導(dǎo)。在此表示感謝！

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The function of the polyketide synthase OsPKS1 and OsPKS2 in regulating pollen wall formation in rice

ZHOU YuLu1, LIN Hong1, ZHANG DaBing1,2, Wang CanHua1, YU Jing1

(1School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240;2School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide; Australia SA 5005)

【Background】Plant pollen is surrounded by pollen wall which acts as a natural protective barrier for male gametes and plays a pivotal role in plant reproductive development. The main component of pollen wall is sporopollenin, which is mainly composed of lipidic and phenolic substances. Therefore, the metabolism of these two substances is a key step for anther wall and pollen wall formation. PKS1/PKSA/LAP6 and PKS2/PKSB/LAP5 show conserved biochemical functions in sporopollenin biosynthesis pathways among different species. 【Objective】The role ofand【Method】A gene co-expressed network, AntherNet predicted a genethat might be involved in sporopollenin biosynthesis, using the CRISPR/Cas9 genome editing system to generateandsubspecies 9522 background andbackground, respectively. Under the same growth condition, the vegetative growth and floral organ development of the mutant plants were analyzed by comparing the phenotypes of the wild type and the mutants. I2-KI staining was utilized to analyze the pollen viability ofand. Semi-thin section was performed to observe four cell layers and microspore development in the wild type and the mutants at different stages. Scanning electron microscope (SEM) was used to observe the fine structures of anther wall outer and inner surface as well as pollen wall surface both in the wild type and the mutants. And transmission electron microscopy (TEM) was performed to observe the fine structures of anther wall cell, Ubisch body and pollen wall of the wild type and the mutants.【Result】Fourand fourwere obtained by CRISPR/Cas9 approach, among whichandwere homozygous mutants. Bothandwere male sterile.anddisplayed abnormal pollen wall and Ubisch body, however, the detailed morphology was different between two mutants.could form convex wall structure on the surface of pollen wall and the tapetal layer could be normally degraded; a large number of tiny cavities were formed in the inner structure of pollen wall and the bacula became shorter, which might cause invalid connection between tectum and nexine; the bottom structure of Ubisch bodies was decreased while the top structure was increased and Ubisch bodies were sharper thanthose of the wild type. By observing, it was found that the cuticle was reduced and thetapetal layer could not be degraded normally. Besides, there was no obvious pollen wall structure on the surface of microspores and the microspores were degraded at stage 11; Ubisch bodies were less formed with abnormal structure at stage 9 and were detached from the anther wall at stage 11. 【Conclusion】The function of//and//are conserved among various species and could affect the biosynthesis and accumulation of sporopollenin. However, these two genes show different function for the formation of the inner structure of pollen wall and Ubisch bodies in rice:is more important for the formation of bacula and the bottom structure of Ubisch bodies;is more important for the formation of tectum and the top structure of Ubisch bodies. Theyregulate the formation of pollen wall, anther wall and the degradation of tapetum.

;OsPKS1; OsPKS2; sporopollenin; pollen wall; male sterile

2018-12-10；

2019-01-24

國家自然科學(xué)基金（31700276）

周雨露，E-mail：754877377@qq.com。 通信作者王燦華，E-mail：wangcanhua@sjtu.edu.cn。通信作者余婧，E-mail：yujing@sjtu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.001

（責(zé)任編輯 李莉）