翟婭菲，張星稀，相啟森，趙倫旭，何乃磊，申瑞玲

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002）

南瓜（Cucurbit moschata Duch.）富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有潤肺、健脾胃、消炎止痛、緩解腹脹等功效，是受廣大群眾喜愛的一種瓜類蔬菜。南瓜中的生物活性化合物豐富，尤其是具有防治糖尿病功效的南瓜多糖倍受關(guān)注[2-3]。南瓜多糖能夠顯著增加四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的胰島素水平，并能修復(fù)受損的胰島組織與肝組織細(xì)胞。南瓜多糖還可顯著提高血清及肝組織中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的量，并使肝組織中丙二醛和NO 的含量顯著降低[4]。近年來，關(guān)于南瓜多糖的研究主要集中于其分離提取方法及其防治糖尿病的機(jī)理[5-6]，而對(duì)南瓜多糖的其它功效研究較少。早期研究報(bào)道南瓜多糖具有抑菌效果[7-8]，然而不同因素對(duì)南瓜多糖體外抑菌效果的影響仍然未知。本研究分別探索了南瓜多糖對(duì)屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌、屬于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和屬于真菌的魯氏接合酵母的抑制作用，就不同濃度、溫度、pH 值對(duì)南瓜多糖體外抑菌效果的影響進(jìn)行了研究，確定了南瓜多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，以期為南瓜多糖的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南瓜：市售；無水乙醇、丙酮、HCl、NaOH 等試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Luria-Bertani 培養(yǎng)基（LB）和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：青島海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌O157：H7 （Escherichia coli O157：H7）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）：鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室所有。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜多糖的制備

選取肉質(zhì)呈橘黃色的成熟期較長的南瓜，清洗表面并去掉南瓜外表皮及籽粒，切成薄片后烘干。烘干后冷卻至室溫的南瓜片經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40 目篩，所得南瓜粉用于南瓜多糖的進(jìn)一步提取。取一定量南瓜粉并加入35 倍的蒸餾水，于80 ℃攪拌浸提2 h。過濾后取上清液并適當(dāng)濃縮，然后用4 倍體積的95%乙醇沉析多糖，4 ℃下靜置12 h 后過濾取沉淀。所得沉淀分別經(jīng)95%乙醇、丙酮和無水乙醇洗滌去除雜質(zhì)后，干燥保存。

1.2.2 菌種的活化及菌懸液的制備

從保存斜面上分別挑取一環(huán)大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌接種到滅菌的LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min 條件下恒溫震蕩培養(yǎng)12 h 以活化菌種。挑取一環(huán)魯氏接合酵母接種到滅菌的YPD 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r/min 條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24 h 以活化菌種。以無菌生理鹽水稀釋活化的菌懸液，使其濃度為107cfu/mL～108cfu/mL。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定方法

稀釋后的大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌菌懸液各取150 μL，分別加到LB 固體培養(yǎng)基平板上并涂布均勻。取150 μL 稀釋后的魯氏接合酵母菌懸液，均勻涂布到Y(jié)PD 固體培養(yǎng)基表面。待菌液滲入固體培養(yǎng)基后，在每個(gè)平板上放置4個(gè)滅菌的牛津杯。其中3個(gè)各加入100 μL 經(jīng)同一條件處理的待測(cè)樣品，另一個(gè)加入等量無菌水作為陰性對(duì)照。含大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的平板經(jīng)處理后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，含魯氏接合酵母的平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h，最后以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 濃度對(duì)南瓜多糖體外抑菌效果的影響

用無菌水配制濃度為 200、100、50、25 mg/mL 以及12.5 mg/mL 的南瓜多糖溶液，采用牛津杯法檢測(cè)并比較不同濃度的南瓜多糖對(duì)大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌以及魯氏接合酵母菌的抑菌圈大小。

1.2.5 溫度對(duì)南瓜多糖體外抑菌效果的影響

將200 mg/mL 的南瓜多糖溶液分別置于37、60、80 ℃和100 ℃的恒溫水浴中處理30 min，待冷卻至室溫后分別取100 μL 加入牛津杯中，做3 組重復(fù)并以無菌水作對(duì)照。以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.6 pH 值對(duì)南瓜多糖體外抑菌效果的影響

用 1 mol/L HCl 溶液和 1 mol/L NaOH 溶液將200 mg/mL 的南瓜多糖溶液分別調(diào)成pH 值為2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0 的不同溶液，采用牛津杯法檢測(cè)不同pH 值的南瓜多糖的體外抑菌效果。

1.2.7 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

根據(jù)均勻試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果處理南瓜多糖，之后用無菌水分別配制成濃度為 3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL 的溶液，采用牛津杯法測(cè)定其對(duì)大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌圈，以能出現(xiàn)抑菌圈的最低濃度作為最小抑菌濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS16.0 及Excel 軟件進(jìn)行單因素的方差分析以及均勻試驗(yàn)的回歸分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度南瓜多糖的抑菌效果

不同濃度南瓜多糖的抑菌效果見表1。

如表1所示，南瓜多糖對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157：H7 和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小隨濃度的增加而逐漸增大，然而南瓜多糖即使?jié)舛仍黾拥?00 mg/mL 仍對(duì)屬于真菌的魯氏接合酵母沒有抑制作用。萬艷娟等人報(bào)道南瓜多糖對(duì)屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，而對(duì)黃曲霉和黑曲霉這兩種真菌沒有抑制作用[7]。綜合本文的結(jié)果與之前的報(bào)道可以推測(cè)，南瓜多糖對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌具有較好的抑制效果，而對(duì)真菌沒有抑制作用。同一濃度下，南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌O157：H7，這與郭奇等的報(bào)道一致[8]。當(dāng)南瓜多糖的濃度增加到200 mg/mL 時(shí)，其對(duì)大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到了9.53 mm 和9.68 mm。這一結(jié)果表明，南瓜多糖的濃度與其抑菌活性呈正相關(guān)，即南瓜多糖的濃度越大，其抑菌活性越強(qiáng)。

表1 不同濃度南瓜多糖的抑菌效果Table 1 The antibacterial effects of different concentrations of pumpkin polysaccharide

2.2 經(jīng)不同溫度處理的南瓜多糖的抑菌效果

南瓜多糖經(jīng)不同溫度處理后對(duì)大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出不同的抑制效果，說明溫度會(huì)影響南瓜多糖的抑菌活性。南瓜多糖的這一性質(zhì)與紅薯莖葉多糖提取物和韭菜提取液相同[9-10]。

不同溫度處理后的南瓜多糖的抑菌作用見圖1。

圖1 不同溫度處理后的南瓜多糖的抑菌作用Fig.1 Antibacterial effects of pumpkin polysaccharides dealt with different temperatures

如圖1所示，對(duì)大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌，當(dāng)南瓜多糖在37 ℃和60 ℃的溫度下處理后，其抑菌圈的大小變化不明顯。當(dāng)處理溫度升高到80 ℃時(shí)，南瓜多糖能產(chǎn)生最大的抑菌圈，其直徑分別可達(dá)9.78 mm 和9.84 mm，進(jìn)一步將處理溫度提高到100 ℃會(huì)使南瓜多糖產(chǎn)生的抑菌圈直徑大幅度減少。這說明南瓜多糖的抑菌活性具有熱穩(wěn)定性，處理溫度升高到一定程度會(huì)破壞南瓜多糖的結(jié)構(gòu)，從而降低其抑菌效果，這一結(jié)論與Khan 等的研究結(jié)果相符[11]。

2.3 不同pH值的南瓜多糖的抑菌效果

南瓜多糖在 pH 值為 2.0、4.0、6.0、7.0、8.0 和 10.0時(shí)的抑菌活性結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH值的南瓜多糖的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effects of pumpkin polysaccharides with different pH values

在pH 值為6.0 的條件下，南瓜多糖對(duì)大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑制作用均最強(qiáng)，其抑菌圈直徑分別為9.66 mm 和9.88 mm。對(duì)于同種菌，當(dāng)pH 值小于6 時(shí)，南瓜多糖的抑菌活性隨著酸性的增強(qiáng)而減弱；當(dāng)pH 值大于6 時(shí)，南瓜多糖的抑菌活性隨著堿性的增強(qiáng)而減弱。南瓜多糖的這一性質(zhì)與枸杞多糖和黃芪多糖相同，推測(cè)是由于在酸或堿條件下多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而減弱了其自身的抑菌活性[12]。此外，在相同pH 值條件下，南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌O157：H7，這與相同濃度下酸堿度呈中性的南瓜多糖對(duì)兩種菌的抑制效果相同。

2.4 均勻試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，以抑菌圈直徑作為檢測(cè)指標(biāo)，采用三因素六水平6 組試驗(yàn)的方式設(shè)計(jì)U6（63）均勻試驗(yàn)表考察南瓜多糖的濃度（X1）、處理溫度（X2）以及pH 值（X3）對(duì)南瓜多糖體外抑菌活性的影響。U6（63）均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表3。

表3 U6（63）均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 3 U6（63）table of uniform design

2.5 均勻試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)均勻試驗(yàn)表，在相應(yīng)條件下分別進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，所得各組抑菌圈直徑結(jié)果如表4所示。

表4 均勻試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of uniform design

2.6 回歸分析

以金黃色葡萄球菌為例，采用SPSS 軟件和Excel對(duì)均勻試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[13]。先進(jìn)行多元線性回歸分析，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.945，決定系數(shù)R2=0.892，方差分析顯著性P=0.157＞0.05，說明多元線性回歸模型不能顯著地解釋自變量與因變量之間的變化，需使用多元非線性回歸模型進(jìn)行回歸分析。

經(jīng)多元多項(xiàng)式回歸分析，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R 及決定系數(shù)R2均為1.00，表明此回歸模型能較好地揭示自變量與因變量之間的關(guān)系，確定方程為Y=9.16-0.18X2+0.02X2X3+0.000 034X12-0.005X32。在測(cè)試條件范圍內(nèi)，經(jīng)過計(jì)算得到最佳優(yōu)化條件為：南瓜多糖濃度200 mg/mL，溫度100 ℃，pH 值為10 時(shí)，南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)12.02 mm。經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，在此優(yōu)化條件下得到的南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈為11.65 mm，與理論值相差0.37 mm，且遠(yuǎn)超過各試驗(yàn)值，說明均勻試驗(yàn)優(yōu)化后的最優(yōu)條件使南瓜多糖均有最強(qiáng)的抑菌活性。

2.7 南瓜多糖的最小抑菌濃度

將南瓜多糖配制成7 種不同濃度的溶液，調(diào)節(jié)其pH 值均為10，并在100 ℃恒溫水浴中處理30 min，隨后測(cè)定其抑菌效果，結(jié)果見表5。

表5 南瓜多糖的最小抑菌濃度Table 5 The minimal inhibitory concentration of pumpkin polysaccharide

南瓜多糖在濃度為12.5 mg/mL 時(shí)對(duì)大腸桿菌O157：H7 有抑制效果，而在濃度為6.25 mg/mL 時(shí)對(duì)大腸桿菌O157：H7 沒有抑制作用。說明在試驗(yàn)濃度內(nèi)，南瓜多糖對(duì)大腸桿菌O157：H7 的最小抑菌濃度為12.5 mg/mL。對(duì)于金黃色葡萄球菌，南瓜多糖在濃度為6.25 mg/mL 時(shí)有抑制作用，而在濃度降低到3.125 mg/mL時(shí)失去抑制效果，說明南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為6.25 mg/mL。這些結(jié)果表明南瓜多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，與抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果相符。萬艷娟等報(bào)道南瓜多糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為2 mg/mL[7]，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，分析可能存在以下原因：所選南瓜的品種有差別，南瓜多糖的提取方法存在差異。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以牛津杯法檢測(cè)了南瓜多糖的體外抑菌活性。南瓜多糖對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157：H7 以及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果，而對(duì)真菌魯氏接合酵母不具有抑制效果。不同條件處理得到的南瓜多糖具有不同的抑菌活性。南瓜多糖的抑菌活性與其濃度正相關(guān)，并在一定范圍內(nèi)隨著處理溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)抑菌活性達(dá)到最大。此外，酸性或堿性條件都會(huì)對(duì)南瓜多糖的抑菌活性產(chǎn)生影響。通過均勻試驗(yàn)優(yōu)化，得到最佳的優(yōu)化條件為：濃度 200 mg/mL，溫度 100 ℃，pH 值為10。經(jīng)此條件處理的南瓜多糖，體外抑菌活性最強(qiáng)。