封易成，牟德華

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000）

山楂屬于薔薇科（Rosaceae），它在歐洲和中國(guó)已經(jīng)成為預(yù)防和治療心臟病的多效傳統(tǒng)藥物[1-3]。追溯到20世紀(jì)初，山楂被用于改善血液循環(huán)，并治療失眠[4-6]。在英國(guó)，山楂用于心肌功能障礙，高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化[7]。其果實(shí)在中國(guó)用于治療血液循環(huán)障礙[8]。山楂果實(shí)，葉子和花的提取物可以預(yù)防高血壓和心力衰竭等疾病[9-10]。山楂的水提取物具有降血脂、抗炎和血液流變學(xué)的改善等多種功能[11-13]。植物性果實(shí)中的有機(jī)酸在預(yù)防飲食引起的慢性疾病（骨質(zhì)疏松癥，肥胖）方面發(fā)揮重要作用[14-15]。

離子液體（ionic liquid，ILs）被定義為有機(jī)鹽，由大分子有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成[16]。離子液體具有許多獨(dú)特的性質(zhì)，如化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、不可燃性、高導(dǎo)電性，并且表現(xiàn)出對(duì)各種化合物良好的溶解性[17-20]。實(shí)際上，離子液體被認(rèn)為是“綠色”溶劑的原因在于離子液體的揮發(fā)性非常低，可以避免大氣污染[21]。使用離子液體比使用普通有機(jī)溶劑的一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是離子液體的極性、疏水性、黏度和溶劑混溶性可以有效的通過(guò)改變陽(yáng)離子、陰離子和連接的取代基進(jìn)行調(diào)整[22-23，17]。離子液體作為綠色溶劑，在環(huán)境友好型和回收利用方面具有無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)和潛力，非常適用于對(duì)安全性要求較高的醫(yī)藥和食品行業(yè)[24]。

微波輔助提取在食品方面的應(yīng)用之前也有所報(bào)道。微波輔助提取是一種有前景且有效的技術(shù)，可在更短的時(shí)間內(nèi)保證更高的產(chǎn)量[25-26]。微波使得細(xì)胞破裂，從而有利于提取溶劑進(jìn)入以溶解目標(biāo)化合物，可以更快的提取并防止目標(biāo)化合物的降解[27]。

本文采用了一種使用離子液體酶法微波輔助提取山楂有機(jī)酸的新技術(shù)，旨在探索一種綠色、便捷提取有機(jī)酸，同時(shí)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)造成最小可能損害的方法。試驗(yàn)條件使用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化。最后，將這種方法與其他提取方法的結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂來(lái)自河北省承德興隆縣，為新鮮的鐵山楂，篩選直徑范圍為2.3 cm～2.8 cm，每個(gè)鮮果質(zhì)量為9.3 g～11.3 g 之間，平均含水率為74.6%。

纖維素酶（酶活≥400 U/mg）、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸氫二鹽（1-Butyl-3-methylimidazolium hydrogen phosphate di-salt [Bmim]H2PO4）、溴化 1-丁基-3-甲基咪唑（1-Butyl-3-methylimidazolium bromide [Bmim]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸鹽（1-Butyl-3-methylimidazolium sulfate [Bmim]2SO4）、溴化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hydroxy-3-methylimidazolium bromide [Hmim]Br）、氯化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hexyl-3-methyl imidazole chloride [Hmim]Cl）、溴化1-乙基-3-甲基咪唑（1-Bromo-3-methylimidazolium bromide [Emim]Br）：上海寶曼生物科技有限公司；沒(méi)食子酸、丁二酸、DL-蘋有機(jī)酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫銨：天津市精細(xì)化工有限公司；檸檬酸、酒石酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MICHEM ME6-TC 微波樣品處理平臺(tái)：北京盈安美誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司；LC-20AT SHIMADZU 高效液相色譜儀：日本島津公司；Adventurer 分析電子天平：美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；78-1 型磁力攪拌器：江蘇大地自動(dòng)化儀器廠；VaCo2 冷凍干燥機(jī)：德國(guó)ZIRBUS有限公司；HC-200 型華晨高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠。

1.3 方法

1.3.1 山楂粉的制備

使用冷凍干燥機(jī)將去核山楂冷凍干燥，用粉碎機(jī)打碎，過(guò)40 目篩，得到山楂粉，放于干燥器中備用。

1.3.2 浸泡法提取山楂有機(jī)酸

山楂有機(jī)酸的浸泡提取法參照《中國(guó)藥典》（一部）[28]，稱取山楂細(xì)粉1 g，加入去離子水100 mL，室溫浸泡4 h，時(shí)時(shí)振搖，濾過(guò)，量取濾液25 mL，加去離子水50 mL，加酚酞指示液2 滴，用0.1 mol/LNaOH 滴定，每 1 mL NaOH 滴定液相當(dāng)于 6.404 g 枸櫞酸（C6H8O7），含有機(jī)酸按枸櫞酸計(jì)。

1.3.3 離子液體酶法微波輔助制取山楂有機(jī)酸

稱取2 g 山楂粉于圓底燒瓶中，加入纖維素酶和離子液體水溶液混勻，置于微波樣品處理平臺(tái)中提取9 min，離心得上清液，取1 mL 上清液，加去離子水20 mL，用0.1mol/LNaOH 滴定，計(jì)算有機(jī)酸含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)各因素水平設(shè)置如下：離子液體[Bmim]H2PO4、[Bmim]Br、[Bmim]2SO4、[Emim]Br、[Hmim]Br、[Hmim]Cl；離子液體濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L；纖維素酶添加量為樣品質(zhì)量的0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%；液料比為 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），反應(yīng)溫度為 35、45、55、65、75 ℃；提取時(shí)間為 10、15、20、25、30、35 min。分別考察上述 5個(gè)因素對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響。

1.3.5 提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，利用Box-Behnken 試驗(yàn)原理，以離子液體添加量、纖維素酶添加量、液料比及提取時(shí)間為變量，有機(jī)酸含量為響應(yīng)值，選用二次回歸方程，進(jìn)行有機(jī)酸提取工藝條件的優(yōu)化，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded and actual values for the factors used in response surface analysis

1.3.6 有機(jī)酸組分的液相色譜測(cè)定

液相色譜條件：選用迪馬Platisil ODS C18[4.6×250 mm ID，5 μm]色譜柱，0.02 mol/L NaH2PO4（pH2.9）∶乙腈（98∶2，體積比）緩沖溶液為流動(dòng)相，控制流速為0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm，進(jìn)樣量20 μL。用草酸、酒石酸、L-蘋有機(jī)酸、抗壞血酸、檸檬酸、沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)定樣品的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)計(jì)算其含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），所得數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 離子液體種類對(duì)有機(jī)酸含量的影響

離子液體的種類對(duì)提取效果影響較大，為了尋找最佳的離子液體，研究了6 種不同陰離子和碳鏈長(zhǎng)度作為陽(yáng)離子的離子液體，因?yàn)橛袡C(jī)酸大部分為水溶性化合物，所以選取的6 種離子液體均為親水性。離子液體種類對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 離子液體種類對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響Fig.1 Effects of ionic liquids on hawthorn acid content

如圖1所示，取同樣濃度的不同陰陽(yáng)離子的離子液體提取山楂中的有機(jī)酸時(shí)，用[Bmim]Br 提取得到的有機(jī)酸含量最高，且具有顯著性，離子液體的親脂性隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增加，[Bmim]+為短鏈陽(yáng)離子，親水性強(qiáng)，[Bmim]Br 具有很高的溶解纖維素的能力，溶解了植物細(xì)胞的壁，這有助于有機(jī)酸的提取[29]。這一現(xiàn)象可能和 [Bmim]Br 與有機(jī)酸之間的氫鍵有關(guān)[30]。所以選取[Bmim]Br 作為提取劑用于進(jìn)一步提取研究。

2.1.2 離子液體濃度對(duì)有機(jī)酸含量的影響

離子液體濃度對(duì)有機(jī)酸含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 離子液體濃度對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響Fig.2 Effect of ionic liquid concentration on hawthorn acid content

提取有機(jī)酸含量隨著離子液體濃度增加而增加，到0.04 mol/L 時(shí)含量達(dá)到最高。這是因?yàn)殡x子液體可以溶解更多的植物纖維并促進(jìn)溶液進(jìn)入細(xì)胞[31]。同時(shí)，離子液體的微波吸收能力和傳輸能力通過(guò)增加其濃度而增強(qiáng)[32-33]。離子液體具有較強(qiáng)的催化活性，在與酶結(jié)合提取植物有機(jī)酸時(shí)，酶活性都比其在有機(jī)溶劑中高[34]，此外，高濃度離子液體穿透細(xì)胞壁的能力增強(qiáng)，從而提高了提取能力[35]。適當(dāng)?shù)碾x子液體添加能夠增強(qiáng)纖維素酶的催化活性，但當(dāng)離子液體添加量過(guò)大時(shí)，[Bmim]Br 濃度越大，黏度越大，[Bmim]Br 更難以穿透樣品基質(zhì)，阻礙了纖維素酶與底物的結(jié)合，從而影響到纖維素酶的催化作用，降低酶解速率[36，18]。從圖2中可以看出，當(dāng)離子液體濃度為0.04 mol/L 時(shí)，目標(biāo)分析物的含量最高?？紤]到提取率和經(jīng)濟(jì)節(jié)能，選擇0.04 mol/L[Bmim]Br 作進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對(duì)有機(jī)酸含量的影響

不同提取溫度對(duì)有機(jī)酸含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on hawthorn acid content

隨著提取溫度升高到55 ℃，提取有機(jī)酸含量增加，隨著溫度繼續(xù)升高，有機(jī)酸提取含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，然后隨著溫度的升高有機(jī)酸出現(xiàn)降低后再次升高的趨勢(shì)。這是由于纖維素酶在較高溫度下逐漸失活，而隨著溫度的升高，細(xì)胞壁在高溫下遭到破壞，同時(shí)高溫有利于降低離子液體的粘度，提高離子液體的擴(kuò)散能力和溶解性，從而使提取得到的有機(jī)酸含量升高[37]。為了使有機(jī)酸不受高溫破壞同時(shí)降低耗能，選擇55 ℃的提取溫度用于進(jìn)一步分析。

2.1.4 纖維素添加量對(duì)有機(jī)酸含量的影響

纖維素添加量對(duì)有機(jī)酸含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

山楂中的有機(jī)酸存在于在細(xì)胞內(nèi)，提取的過(guò)程實(shí)際是有效成分溶解并擴(kuò)散到溶劑中的過(guò)程，提取過(guò)程的阻力來(lái)源于細(xì)胞壁、固液界面和流體膜，為了提高提取效率采用破壞細(xì)胞壁的方法，有效降低提取過(guò)程的阻力。細(xì)胞壁中的纖維素分子是由D-葡萄糖殘基通過(guò)β-（1，4）糖苷鍵聚合而成的，它不溶于一般的水和有機(jī)溶劑，當(dāng)纖維素酶破壞β-（1，4）糖苷鍵，可將細(xì)胞壁中的纖維素分子酶解成小分子或水溶性物質(zhì)，從而使山楂中的有機(jī)酸釋放，提高提取效率[38]。當(dāng)纖維素酶添加量在0.2%～1%時(shí)，山楂有機(jī)酸含量隨著加酶量的增加而增加，當(dāng)纖維素酶添加量為1%時(shí)有機(jī)酸含量達(dá)到最高值152.399 mg/g，此時(shí)纖維素酶的添加量已能夠?qū)⑸介?xì)胞壁破壞完全，添加過(guò)量的纖維素酶對(duì)提高含量沒(méi)有很大的影響。

2.1.5 液料比對(duì)有機(jī)酸含量的影響

液料比對(duì)有機(jī)酸含量的影響見(jiàn)圖5。

圖4 纖維素酶添加量對(duì)山楂有機(jī)酸含量影響Fig.4 Effect of cellulase addition on hawthorn acid content

圖5 液料比對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響Fig.5 Effect of liquid ratio on hawthorn acid content

當(dāng)液料比從 15∶1（mL/g）變?yōu)?30∶1（mL/g）時(shí)，提取收率提高?？赡苁且?yàn)殡x子液體促進(jìn)微波能量的傳輸，促進(jìn)了有機(jī)酸的有效溶解。當(dāng)液料比大于30∶1（mL/g）時(shí)，可能由于纖維素酶遭到稀釋，含量較低，從而降低了有機(jī)酸的提取含量。當(dāng)采用響應(yīng)面優(yōu)化提取條件時(shí)，使用 25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）液料比進(jìn)一步分析。

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)有機(jī)酸含量的影響

為了評(píng)估時(shí)間對(duì)提取的影響，用不同的提取時(shí)間進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)。提取時(shí)間對(duì)有機(jī)酸含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6中的結(jié)果表明提取產(chǎn)量隨著提取時(shí)間的增加而增加。延長(zhǎng)提取時(shí)間有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。一方面細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，有利于有機(jī)酸的溶解。另一方面，熱敏性物質(zhì)被破壞，并且生物活性也下降[39]。從圖6可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)酸提取含量升高，到25 min時(shí)達(dá)到提取含量最高點(diǎn)。與傳統(tǒng)水浸泡法相比，離子液體酶法有效的縮短了提取時(shí)間。在進(jìn)一步的單因素試驗(yàn)中用25 min 作為提取時(shí)間。當(dāng)優(yōu)化提取條件時(shí)，20、25 和30 min 的提取時(shí)間用于進(jìn)一步分析。

圖6 提取時(shí)間對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on hawthorn fruit acid content

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以離子液體濃度、纖維素酶添加量、液料比、提取時(shí)間為自變量，以有機(jī)酸含量為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 軟件對(duì)表2所得的有機(jī)酸含量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic regression model for extraction yield

由表3得到A 離子液體濃度、B 液料比、C 纖維素酶添加量、D 時(shí)間為自變量對(duì)有機(jī)酸含量的回歸方程：有機(jī)酸含量=163.93-1.73A-0.53B+1.75C+0.36D-0.75AB-1.05AC-1.48AD+0.35BC+0.82BD+0.32CD-7.65A2-5.11B2-7.92C2-4.39D2。

通過(guò)回歸模型的方差分析表得出，整體模型的P值為0.021 7 小于0.05，表明二次模型顯著，失擬項(xiàng)P值為0.296 06 大于0.05，不顯著，表明此二項(xiàng)模型擬合有效，可以分析和預(yù)測(cè)各因素與響應(yīng)值的關(guān)系。各影響因素的主次順序?yàn)椋篊 纖維素酶添加量＞A 離子液體添加量＞B 液料比＞D 時(shí)間。

2.2.3 各因素的響應(yīng)面分析

為了說(shuō)明離子液體添加量（A），液料比（B），纖維素酶添加量（C）和提取時(shí)間（D）和之間的相互作用，繪制了響應(yīng)面的三維圖像，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。根據(jù)回歸方程得出不同因素的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等高線圖結(jié)果見(jiàn)圖7。

各因素交互作用對(duì)山楂有機(jī)酸含量的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對(duì)有機(jī)酸含量的影響越大，相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小[40]。而由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。從表3回歸分析結(jié)果可以看出，纖維素酶含量對(duì)有機(jī)酸含量影響最大。

2.3 最佳試驗(yàn)條件預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

由Design-Expert 軟件可求得回歸方程的極值點(diǎn)，得到有機(jī)酸提取最佳工藝條件為：離子液體溴化-1-丁基三甲基咪唑濃度為0.039 mol/L、纖維素酶添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間25.3min，在此條件下有機(jī)酸的理論預(yù)測(cè)含量為164.159 mg/g。對(duì)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)修正為：離子液體濃度為0.039mol/L、纖維素酶添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.06%、液料比 30∶1（mL/g）、提取溫度 55 ℃、提取時(shí)間 25 min。測(cè)得有機(jī)酸含量為161.863 mL/g，與預(yù)測(cè)值接近。

圖7 兩因素交互作用對(duì)山楂有機(jī)酸含量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of ramsaric acid content by two-factor interactions

2.4 有機(jī)酸提取物的高效液相色譜分析結(jié)果

按最佳試驗(yàn)條件對(duì)兩種提取方式得到的有機(jī)酸化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定分析，定性結(jié)果及相對(duì)含量見(jiàn)表4。

表4 山楂有機(jī)酸中主要成分及含量Table 4 Hawthorn organic acids in the main components and content

由表4可以看出，由傳統(tǒng)水浸泡法和離子液體酶法兩種方法提取的山楂有機(jī)酸成分相同，采用兩種方法提取有機(jī)酸，其中檸檬酸含量最高，分別占總有機(jī)酸的88.641%和90.858%；其次含量較高的為酒石酸，分別占測(cè)得有機(jī)酸的6.313%和4.959%；含量最少的為沒(méi)食子酸。從提取的主要成分及相對(duì)含量上來(lái)看，兩種提取方法并沒(méi)有很大的區(qū)別，但離子液體酶法微波輔助提取可以破壞山楂細(xì)胞壁，使山楂有機(jī)酸更容易被提取出來(lái)，減少了一些熱敏性成分的破壞，使得提取得到相對(duì)含量有所提高。

兩種提取方法得到的有機(jī)酸主要成分均為檸檬酸，PENGZHAN LIU 等[41]測(cè)定22個(gè)品種山楂中有機(jī)酸的主要成分均為檸檬酸，占總酸含量的55%～82%。Baoru Yang 等[42]測(cè)定的10個(gè)品種山楂中有機(jī)酸的主要成分也均為檸檬酸。有機(jī)酸含量也可能影響果實(shí)中酚類化合物的穩(wěn)定性和漿果對(duì)健康的促進(jìn)作用，糖分含量和糖酸比的不同也會(huì)引起品種和品種間感官特性和生理效應(yīng)的差異[43]。

3 結(jié)論

本研究以山楂為原料，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)離子液體酶法微波輔助提取有機(jī)酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為：離子液體溴化-1-丁基三甲基咪唑濃度為0.039 mol/L、纖維素酶添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取溫度 55 ℃、提取時(shí)間25.3 min，在此條件下有機(jī)酸含量為164.159 mg/g。離子液體酶法微波輔助提取有機(jī)酸的方法與傳統(tǒng)水浸泡法相比，縮短了提取時(shí)間，提高了提取山楂有機(jī)酸的含量，但含量最高的成分均為檸檬酸。

本文提出了一種從山楂果實(shí)中提取有機(jī)酸的有效方法，并提出了一種離子液體酶法微波輔助提取山楂有機(jī)酸的新技術(shù)，希望這種技術(shù)在深入的研究之后更廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥及食品行業(yè)中。