柑橘皮黃酮石灰水提取工藝及果膠去除效果的研究

李繼偉，任璇，周紹慶，李媛，劉夢蝶，焦雄

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

柑橘皮渣是柑橘加工的副產(chǎn)物，我國每年產(chǎn)生的柑橘皮渣均在500 萬噸以上[1]。柑橘皮渣中含有黃酮、果膠等多種生物活性物質(zhì)。黃酮類化合物具有降低血糖血脂[2-4]、調(diào)節(jié)腸道微生物[5]、調(diào)節(jié)消化酶活性[2-3，6-7]、促進(jìn)消化[8]、抗氧化[9]等多種生理功能，有很高的食用、藥用價(jià)值[10]。

溶劑提取法是黃酮提取最常用的方法，乙醇是黃酮提取最常用的溶劑，但其成本較高。堿法提取黃酮是一種廉價(jià)、有效的方法。本課題組前期選用氫氧化鈉水溶液進(jìn)行柑橘皮黃酮的提取，但可溶性果膠也會一起被提取出來，造成黃酮提取液易凝膠化，給后續(xù)純化帶來困難。所以，怎樣經(jīng)濟(jì)高效地提取黃酮，同時(shí)又方便黃酮的后續(xù)純化，是柑橘皮黃酮利用中亟待解決的問題。

柑橘皮渣中存在大量果膠，可溶性果膠能與Ca2+形成“蛋箱型”結(jié)構(gòu)而降低其溶解度，所以在提取過程中使用鈣鹽可降低雜質(zhì)果膠的含量。本試驗(yàn)選用石灰水為提取劑，通過單因素和正交試驗(yàn)來優(yōu)化柑橘皮黃酮的提取條件。同時(shí)，對石灰水提取法、NaOH 提取法和乙醇提取法3 種方法的黃酮得率及所得黃酮提取液中的果膠含量進(jìn)行比較，以期為柑橘皮黃酮的提取及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘皮：60 ℃烘干，粉碎，過40 目篩，干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、無水乙醇（分析純）、α-萘酚（分析純）、咔唑（純度≥97 %）、濃硫酸（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；半乳糖醛酸（純度≥97%）：上海金穗生物科技有限公司。

SHZ-88 型水浴恒溫振蕩箱：金壇市醫(yī)療儀器廠；TDL-5-A 型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；722 型可見光分光光度計(jì)：天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石灰水法提取黃酮流程

取柑橘皮0.5 g，加入一定稀釋度的飽和石灰水，放入恒溫水浴振蕩箱中以120 r/min 振蕩提取，5 000 r/min離心10 min，取上清，即為黃酮粗提液。

1.2.2 黃酮得率的測定方法

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照李繼偉等[11]的方法，以蘆丁含量x（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光值y（OD510）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y=1.169 1x+0.001 4，R2=0.999 9。樣品中黃酮含量的測定依照標(biāo)準(zhǔn)曲線，柑橘皮黃酮得率 P（mg/g）=cV/M

式中：c 為提取液黃酮含量，mg/mL；V 為提取液體積，mL；M 為柑橘皮粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 石灰水法提取黃酮的單因素及正交試驗(yàn)方法

選取飽和石灰水稀釋倍數(shù)（原液、2、4、8、16、32倍）、水浴時(shí)間（0、0.5、1、2、4、6 h）、水浴溫度（20、40、60、70、80、90 ℃）和液料比（10、20、30、40、60、80 mL/g）共4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)至少重復(fù)兩次，結(jié)果取平均值。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，獲得柑橘皮黃酮提取的最優(yōu)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 不同黃酮提取方法的比較

1.2.4.1 不同提取方法對柑橘皮黃酮得率的影響

分別以石灰水、乙醇和NaOH 為提取劑，提取柑橘皮中的黃酮，并對黃酮含量進(jìn)行比較。每種提取方法的最佳條件均為本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化所得。其中，石灰水法的提取條件為：飽和石灰水稀釋4 倍，液料比30 mL/g，90 ℃水浴時(shí)間2 h；乙醇法的提取條件為：乙醇濃度 60%，液料比 30 mL/g，70 ℃水浴 2 h；NaOH 法的提取條件為：NaOH pH 12，液料比30 mL/g，90 ℃水浴3 h。

1.2.4.2 不同提取方法對黃酮提取液中果膠含量的影響

1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照尚雪波等[12]，并稍有改動，具體步驟如下：精密稱取半乳糖醛酸5 mg，蒸餾水定容至50 mL，即得100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 分別置于試管中，加入蒸餾水定容至1 mL，加入0.1 %咔唑-乙醇溶液0.25 mL，加入濃硫酸5 mL，85 ℃水浴20 min，以第一管為空白對照，用分光光度計(jì)在525 nm處測吸光值，以半乳糖醛酸含量x（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光值y（OD525）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y=0.013 9x-0.004，R2=0.999 5。

2）柑橘皮中總果膠測定方法

柑橘皮果膠含量的測定參照丁建東等[13]，并稍有改動，具體方法如下：稱取1 g 柑橘皮，加入75%乙醇溶液 35 mL，80 ℃水浴 10 min，5 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液。重復(fù)上述步驟，直到上清液不再產(chǎn)生molish 反應(yīng)。用蒸餾水將沉淀洗入100 mL 容量瓶中，加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液5 mL，用蒸餾水定容至100 mL，80 ℃水浴振蕩 15 min，然后 5 000 r/min 離心10 min。取上清，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定果膠含量，即為可溶性果膠含量。果膠含量P/%=（cV×103/M）×100

式中：c 為溶液中果膠濃度，mg/mL；V 為溶液體積，mL；M 為樣品質(zhì)量，g。

收集上述步驟所得沉淀，加入1 mol/L 硫酸溶液25 mL，沸水浴 1 h，冷水浴快速冷卻，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用蒸餾水定容至200 mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定果膠含量。不溶性果膠含量計(jì)算同可溶性果膠。重復(fù)本步驟兩次，將3 次所得果膠含量相加，即為不溶性果膠含量。

總果膠含量（%）=可溶性果膠含量（%）＋不可溶果膠含量（%）。

3）不同方法提取的果膠比率的測定方法

由于提取液中含有還原糖等干擾成分，所以采用差減法測定不同方法提取的果膠比率，即提取的果膠比率（%）=柑橘皮中總果膠含量（%）－殘?jiān)泄z占原粉末的比率（%）。參照上述方法，測定1.2.4.1 中不同提取方法所得殘?jiān)泄z的量，計(jì)算并比較各提取方法提取的果膠比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 飽和石灰水稀釋度對黃酮得率的影響

飽和石灰水稀釋倍數(shù)對黃酮得率的影響見圖1。

圖1 石灰水濃度對黃酮得率的影響Fig.1 The effect of lime water concentration on the extraction rate of flavonoids

黃酮得率隨飽和石灰水稀釋度的增加先上升后下降，當(dāng)稀釋倍數(shù)為8 倍時(shí)，黃酮得率最高為5.16 mg/g。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊氖宜焕邳S酮提取，而高濃度的石灰水pH 值過高（試驗(yàn)測得飽和石灰水的pH值為13.56）對黃酮有一定的破壞作用。所以飽和石灰水的稀釋倍數(shù)8 倍為最佳。

2.1.2 水浴時(shí)間對黃酮得率的影響

水浴時(shí)間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 水浴時(shí)間對黃酮得率的影響Fig.2 The effect of water bath time on the extraction rate of flavonoids

黃酮得率隨水浴時(shí)間的延長呈現(xiàn)先快速增加后逐漸平穩(wěn)的趨勢，水浴時(shí)間從0 h 增加到2 h 時(shí)，黃酮得率從3.64 mg/g 提升到5.09 mg/g，水浴時(shí)間繼續(xù)延長至6 h 時(shí)，黃酮得率為5.2 mg/g，增加緩慢，考慮到時(shí)間成本，故選擇最優(yōu)水浴時(shí)間為2 h。

2.1.3 水浴溫度對黃酮得率的影響

水浴溫度對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 水浴溫度對黃酮得率的影響Fig.3 The effect of water bath temperature on the extraction rate of flavonoids

隨著水浴溫度的升高，黃酮得率先增加然后趨于平穩(wěn)；水浴溫度從20 ℃上升至80 ℃時(shí)，黃酮得率從3.95 mg/g 增加到最高5.05 mg/g，當(dāng)水浴溫度升高至90 ℃時(shí)，黃酮得率基本保持不變。故選擇80 ℃為水浴最優(yōu)溫度。

2.1.4 液料比對黃酮得率的影響

液料比對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 液料比對黃酮得率的影響Fig.4 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate of flavonoids

黃酮得率隨液料比的增加而增加，當(dāng)液料比為10 mL/g 時(shí)，黃酮得率為4.35 mg/g，液料比增加到30 mL/g 時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大，為5.06 mg/g，隨著液料比的再增加，黃酮得率基本維持不變。故選擇液料比30 mL/g 為最優(yōu)條件。

2.2 正交及驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果及分析

選取飽和石灰水稀釋度、水浴時(shí)間、水浴溫度進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，其余因素為單因素最佳水平，結(jié)果見表1。

表1 正交水平試驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Table of orthogonal experimental results

各因素對黃酮得率的影響依次為：水浴時(shí)間＞飽和石灰水的稀釋倍數(shù)＞水浴溫度，提取的最優(yōu)條件組合為A1B2C3，對優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證，黃酮的得率為（5.15±0.03）mg/g，表明正交試驗(yàn)所得結(jié)果可靠，即最佳提取條件為：飽和石灰水稀釋4 倍、水浴時(shí)間2 h、水浴溫度90 ℃。

2.3 不同黃酮提取方法比較的結(jié)果

不同黃酮提取方法的比較結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法的比較Table 2 Comparison of different extraction methods

分別以石灰水、乙醇和NaOH 為提取劑，其中石灰水法黃酮得率為5.15 mg/g，與NaOH 提取法黃酮得率的5.26 mg/g 相差不大，但都大于乙醇提取法的黃酮得率，所以石灰水和NaOH 都可以較好的提取柑橘皮中的黃酮。

試驗(yàn)測定，柑橘皮中，可溶性果膠的含量為4.68%，不可溶性果膠的含量為10.68%，總果膠含量為15.36%。其中，乙醇法提取的果膠比率最低，為0.82%；石灰水法提取的果膠比率次之，為1.7%；NaOH 法提取的果膠比率最高，為4.67%，且石灰水提取法和乙醇提取法提取的果膠都遠(yuǎn)低于NaOH 提取法，有利于黃酮類化合物的后期純化。

3 結(jié)論

石灰水提取柑橘皮黃酮的最佳條件為：飽和石灰水稀釋倍數(shù)為4 倍、液料比為30 mL/g、90 ℃水浴2 h，最大黃酮得率為（5.15±0.03）mg/g。試驗(yàn)測得柑橘皮中果膠的含量為15.36%，與文獻(xiàn)相符[12]。不同提取方法比較發(fā)現(xiàn)，NaOH 法黃酮得率與石灰水法相近，但均高于乙醇法。石灰水法黃酮得率與NaOH 法接近，提取的果膠雜質(zhì)卻大幅降低，由4.67%降至1.7%，降低了63.6%，所以結(jié)合后期純化綜合考慮，石灰水法優(yōu)于NaOH 提取法，而乙醇提取法雖然雜質(zhì)果膠含量低，但黃酮得率也較低，而且溶劑成本較高，也會溶解更多脂溶性雜質(zhì)（如柑橘精油等）。所以石灰水提取法既能有效的提取柑橘皮中的黃酮，又有利于黃酮的后期純化。