黃湘湄 吳雅茜 劉穎 梁嘉燁 蘇偉明

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，湛江 524088）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. m）因含有內(nèi)化素、李斯特菌溶血素、蛋白ActA、磷酸脂酶C等毒力因子，極易引發(fā)高的致死率（高達(dá)20%）［1］，同時，形成的生物被膜（Biofoilm，BF）加劇了L. m對不良外界環(huán)境因素的耐受力［2-3］，可在酸性、堿性及低溫條件下生長，而且L. m生活范圍非常廣泛，因此對各類食品的安全構(gòu)成極大的威脅。自美國甜瓜污染L. m造成33人死亡的食源性感染［4］，至死亡率達(dá)15%的27個歐盟成員國報告的2161例L. m污染食品等災(zāi)難性事件的爆發(fā)［5］，已引起各國政府的高度關(guān)注，并被WTO世界衛(wèi)生組織定義為四大食源性致病菌之一［6］。

越來越多的研究顯示，L. m毒力及生物被膜的形成等致病力相關(guān)的生物現(xiàn)象是受細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum-Sensing，QS）自誘導(dǎo)物質(zhì)（Autoinducer，AI）的信號分子調(diào)控的［7-8］。信號分子AI能夠感應(yīng)細(xì)菌種群密度及周圍環(huán)境的變化，當(dāng)信號分子AI-2濃度達(dá)到一定閾值時，可以結(jié)合細(xì)胞膜上的受體并通過信號傳遞系統(tǒng)調(diào)控如毒力等特定基因表達(dá)［9］，因此，通過阻斷信號分子AI-2的傳遞成為控制L.m等致病菌的一個有效策略。而群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSIs）可以阻斷細(xì)菌種內(nèi)或種間信號分子的形成與交流，使致病細(xì)菌及腐敗細(xì)菌的致病能力與致腐能力下降［10］，也使得尋找新型、有效的QSIs成為研究熱點。目前，科學(xué)家通過對海洋生物的研究發(fā)現(xiàn)了許多具有QS系統(tǒng)活性的抑制劑，如海洋紅藻（Delisea pulchra）［11-14］、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtiij）［15］分泌產(chǎn)生的鹵代呋喃酮等多種化合物，與細(xì)菌AI-2類QS信號分子結(jié)構(gòu)類似，通過與信號分子受體蛋白競爭性結(jié)合抑制細(xì)菌QS調(diào)控的多種功能。海洋微生物在物種、生態(tài)、遺傳等方面都呈現(xiàn)豐富的多樣性［16］，其中海洋微生物代謝產(chǎn)物由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性成為篩選、開發(fā)新型QSIs潛在的重要資源寶庫［17-18］。

本研究以測定報告菌哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值作為篩選指標(biāo)，對具有抗菌活性的16株海洋源乳酸菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行L. mAI-2信號分子QSIs的篩選，并對控制L. m的效果進(jìn)行評價，研究旨在為從海洋環(huán)境中篩選與開發(fā)乳酸菌源L. mQSIs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 19111購于廣東省微生物研究所，哈維弧菌（Vibrio harveyi）BB170由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院韓先干教授惠贈，乳酸菌為本實驗室從湛江海域中的海洋動物腸道分離得到的；LB培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）均購置于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。乙酸乙酯、甲醇、乙醇、PBS緩沖液、結(jié)晶紫染色液購于廣州齊云生物技術(shù)有公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100D-WB，東京理化；生化培養(yǎng)箱 SPX-250B-Z，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺 SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；全自動酶標(biāo)儀 Varioskan Flash，美國Thermo Scientific；智能型倒置熒光顯微鏡DMI4000B，德國leica。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌乙酸乙酯提取物的制備 將16株乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基活化，28℃ 140 rpm搖床培養(yǎng)48 h，4℃ 8 000 rpm離心10 min，0.45 μm濾膜過濾得乳酸菌發(fā)酵上清液，加等量乙酸乙酯萃取過夜，并于45℃ 120 rpm真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集的乙酸乙酯粗提物再溶于純水，配成濃度200 mg/mL的工作液備用。

1.2.2 乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. mAI-2類信號分子活性的影響 將實驗室4℃斜面保存的L. mATCC 19111與哈維氏弧菌BB170分別接種于100 mL TSB和LB培養(yǎng)基，37℃和28℃ 120 rpm搖床培養(yǎng)過夜，濃度調(diào)整為108CFU/mL的菌液。分別取200 μL乳酸菌乙酸乙酯提取物工作液及50 μL的L. m菌液加到10 mL TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，4℃12 000 rpm離心10 min取上清與50 μL哈維氏弧菌BB170菌液加到100 mL LB培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)6 h，取200 μL于黑色96孔板，用多功能酶標(biāo)儀生物發(fā)光模式檢測BB170發(fā)光情況。AI-2活性值為含乳酸菌乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)BB170發(fā)光值與發(fā)光值的百分比值，并以無菌水代替抑制劑作為陰性對照的AI-2 活性值定為 100%［19-20］。

1.2.3 QSI對L. m的MIC值測定 采用牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法測定抗菌活性。以L. m為指示菌，分別向牛津杯孔中加入200 μL 濃度為125、250、500 μg/mL的QSI，超純水為空白對照組，4℃靜置擴(kuò)散4 h，37℃培養(yǎng)24 h后，將能夠L. m抑制出現(xiàn)明顯增長的最低濃度定為最抑制濃度（MIC）［21］。

1.2.4 QSI對L. m生長的影響 取50 μL濃度為108CFU/mLL. m菌液接種到100 mL含QSI終濃度分別為 125、250、500、1 000 μg/mL的 TSB培養(yǎng)基中，以不含QSI組作為陰性對照組，TSB培養(yǎng)基作為調(diào)零組，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，每1 h于取樣并在波長600 nm處測量吸光值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制不同濃度的QSI作用下L. m的生長曲線［22］。

1.2.5 QSI對L. m動力的影響 將含有0.4 %瓊脂的TSB培養(yǎng)基加入無菌試管，添加終濃度為125、250、500 μg/mL的QSI混勻，以不含QSI作空白對照組，凝固后用接種針將L. m垂直穿刺接種，28℃下培養(yǎng)48 h，觀察QSI對L. m動力的影響［22］。1.2.6 QSI對L. m生物膜形成的抑制

1.2.6.1 生物膜形成的定量檢測 將濃度為108CFU/mLL. m菌液 10 μL接種到 190 μL含 QSI終濃度分別為125、250、500 μg/mL的TSB培養(yǎng)基的96板孔中，以不含QSI為陰性對照組。37℃靜置培養(yǎng)48 h，小心棄去上層菌液，以pH7.0的PBS洗去沉淀物附著的浮游菌，棄去后再加入1%結(jié)晶紫200 μL染色，室溫放置15 min，棄去染液，蒸餾水洗孔多次后室溫干燥，每孔加入200 μL的95%乙醇，以95%乙醇作為調(diào)零組，595 nm吸光度下測定生物膜生長情況及計算抑制率［23］。

1.2.6.2 生物膜的形貌觀察 將無菌玻片置于6孔板中，并向孔中加入3 mL含QSI終濃度為125、250、500 μg/mL的 TSB培養(yǎng)基和 10 μLL. m菌液，以不含QSI作陰性對照組，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，取出玻片，用pH7.0的PBS反復(fù)洗去玻片表面的浮游菌，使用1%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗玻片，室溫下晾干，光學(xué)顯微鏡觀察生物膜的形貌［24］。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 每個實驗作3個平行，取其平均值，實驗數(shù)據(jù)用x-±s 表示。采用SPSS的單因素方差分析（ANOVA）樣品的顯著性差異，檢驗水準(zhǔn)為 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 L. m AI-2類群體感應(yīng)抑制劑的篩選

以不含乳酸菌乙酸乙酯提取物的L. m上清液誘導(dǎo)BB170發(fā)光值作為100%、LB培養(yǎng)基為空白對照。16株乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. mAI-2信號分子的活性均表現(xiàn)出一定抑制效果（圖1），抑制率從36%至98.5%，其中6株菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物A-3、A-4、B-1、B-4、B-5、C-3能夠有效地抑制L. mAI-2的活性，與陰性對照相比，抑制率均超過了75%，可作為潛在的L. m的QSIs，尤其菌株P(guān)ediococcus pentosaceuszy-B-1的代謝產(chǎn)物B-1對L. mAI-2活性幾乎完全抑制，活性僅保留了1.5%，將其命名QSI-B-1，并進(jìn)一步研究對L. m的抑制效果。

圖1 乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. m AI-2活性的影響

2.2 QSI-B-1對L. m作用的MIC值

采用雙層牛津杯擴(kuò)散法對QSI-B-1進(jìn)行抗菌活性測定（圖2），發(fā)現(xiàn)500 μg/mL的QSI-B-1較明顯地抑制了L. m的生長，抑菌圈18 mm；250 μg/mL的QSI-B-1可觀察到較小的透明圈約10 mm，125 μg/mL與空白對照組沒有完全透明的抑菌圈，因此QSI-B-1對L. m作用的 MIC值為 250 μg/mL。125、250 μg/mL的QSI-B-1的孔能觀察到較為稀疏的L. m的生長圈。

2.3 QSI-B-1對L. m生長曲線的影響

圖2 QSI-B-1的MIC值測定

生長曲線實驗（圖3）可以表明不同濃度QSI-B-1對L. m生長的影響，1 000 μg/mL的QSI-B-1完全抑制了L. m的生長；≤500 μg/mL的QSI-B-1隨著濃度增大抑制作用加強(qiáng)，最大OD值變小說明降低最終生長濃度，這與2.2的抑菌圈結(jié)果一致。同時QSI-B-1能推遲L. m進(jìn)入對數(shù)生長期的時間，并均于11 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期。

圖3 不同濃度QSI-B-1作用下L. m生長曲線

2.4 QSI-B-1對L. m動力形成的影響

通過半固體穿刺培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)（圖4），空白對照組形成傘狀生長線，邊緣呈云霧狀，表明L. m具有運動性；在125 μg/mL的QSI-B-1作用下L. m較空白對照組形成較細(xì)小的傘狀生長線，在250 μg/mL的QSI-B-1作用下未觀察到傘狀生長，表明其抑制了L.m鞭毛的形成；濃度為500 μg/mL的QSI-B-1幾乎有效的抑制L. m的生長。

圖4 QSI-B-1對L. m動力的影響

2.5 QSI-B-1對L. m生物被膜形成的抑制

濃度為 125、250、500 μg/mL的 QSI-B-1作用L. m48 h后，生物被膜的形成量均低于陰性對照組（圖5），且隨著QSI-B-1濃度的增大，對生物被膜形成的抑制效果越明顯，抑制率分別為89.94%、66.16%、40.85%。

圖5 不同濃度QSI-B-1作用下L. m生物被膜的形成量

2.6 QSI-B-1對L. m生物被膜形貌的影響

熒光倒置顯微鏡觀察QSI-B-1作用48 h后L. m的生物被膜的形貌發(fā)現(xiàn)（圖6），未添加QSI-B-1的空白對照組的L. m在玻片上形成了特有的三維蘑菇狀生物被膜，結(jié)構(gòu)完整致密。實驗組隨著QSI-B-1濃度的增加，形成的生物膜結(jié)構(gòu)愈加疏松，500 μg/mL組幾乎不能成膜。

3 討論

圖6 不同濃度QSI-B-1對L. m生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

AI-2類群體感應(yīng)抑制劑（QSIs）能夠阻斷細(xì)菌種間信息的交流，靶向抑制或干擾細(xì)菌QS功能的正常發(fā)揮，為開發(fā)新型食品病源菌控制劑提供了思路［25］。QSIs主要通過抑制信號分子的合成、促進(jìn)信號分子的降解或阻斷信號分子與受體蛋白結(jié)合3條途徑來干擾細(xì)菌的QS系統(tǒng)［26］，其中，通過抑制信號分子的活性來篩選QSIs成為研究熱點。

QSIs可以通過人工合成，也可以從動植物及微生物中篩選獲得［27］。乳酸菌是自然界中很重要的一類抑菌活性強(qiáng)且抑菌譜廣的生防菌，乳酸菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生很多種類的抑菌活性物質(zhì)，抑制多種病原菌，是獲得QSIs的重要來源，李博［28］、顧銳［29］和蔡針華［30］等從多株乳酸菌的上清液篩選QSIs，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的代謝產(chǎn)物作為外源化合物能夠明顯地抑制致病菌L. m信號分子的活性，是靶向干擾 QS 正常功能的 QSI［31］。

本實驗采用報告菌株哈氏弧菌BB170只對AI-2類分子發(fā)生反應(yīng)并誘導(dǎo)其發(fā)光，且AI-2活性值的高低與發(fā)光度呈正相關(guān)［32-33］，篩選得到低濃度的乳酸菌上清液的粗提物，并從生長曲線、動力、生物被膜三個方面探究其對致病菌L. m群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制效果。對致病菌動力形成的抑制實質(zhì)是對其鞭毛運動的抑制，是間接控制致病菌感染與致病能力的一個途徑［34］。邢家溧等［35］發(fā)現(xiàn)溴化呋喃酮DF可以明顯地抑制了熒光假單胞菌的群集運動能力，繼而影響了其生物膜的形成；唐藝丹［34］等發(fā)現(xiàn)400 μg/mL的絲狀真菌產(chǎn)生的丁內(nèi)酯-I是銅綠假單胞菌的QSI，且能有效地抑制其運動能力，說明多種QSIs均對致病菌的動力有抑制效果。細(xì)菌生物被膜是由QS系統(tǒng)在信號分子的調(diào)控下菌體自發(fā)形成的菌體、胞外蛋白和多糖的混合物，其不僅使菌體易于附著在食品加工設(shè)備等固體材料的表面，使得通過清洗手段去除菌體變得困難，而且形成的保護(hù)性被膜增強(qiáng)了菌體對外界不良因素的抵抗性，使菌體容易逃逸藥物的抑制作用，據(jù)統(tǒng)計超過60%的微生物感染是由細(xì)菌的生物被膜引起的［10］，抑制致病菌L. m的生物膜的形成能減少其抗逆性。QSI靶向干擾目標(biāo)菌的QS系統(tǒng)，但并不是完全殺死細(xì)菌，從而有效地抑制毒力因子的產(chǎn)生，避免了食品使用高劑量抑菌劑帶來的耐藥性［10］及人體副作用造成的危害。本研究結(jié)果表明，海洋源乳酸菌乙酸乙酯提取物作為QSIs有望成為控制L. m感染和致病性的有力武器，研究旨在通過靶向干擾QS系統(tǒng)的這一策略，抑制細(xì)菌生物被膜與毒力因子的形成，從而控制其致病性，為研發(fā)新型食源性致病菌抑制劑提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究篩選得到6株乳酸菌的乙酸乙酯提取物為良好L. mAI-2系統(tǒng)的QSIs，其中菌株P(guān)ediococcus pentosaceuszy-B-1乙酸乙酯提取物QSI-B-1抑制效果最好，推遲L. m進(jìn)入生長期的時間并有效降低其最終生長濃度，并抑制鞭毛的運動，間接控制了L. m的感染力和致病能力。隨著QSI-B-1濃度的增加，對L.m生物被膜形成量的抑制率越高，形成的生物被膜結(jié)構(gòu)愈加疏松。