馬鈴薯淀粉合成與降解研究進(jìn)展

何虎翼 唐洲萍 楊鑫 樊吳靜 譚冠寧 李麗淑 何新民

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，南寧 530007）

馬鈴薯是我國第四大糧食作物和重要的工業(yè)原料作物，我國是馬鈴薯生產(chǎn)的第一大國，已形成四大主產(chǎn)區(qū)，2017年全國馬鈴薯種植面積598萬hm2，總產(chǎn)量1.2億t，占全國糧食產(chǎn)量的20%，占世界馬鈴薯總產(chǎn)量的1/4左右。馬鈴薯是C3作物，其CO2補償點很高，光合效率較低。與甘薯、山藥、芋頭等塊莖類作物相比，馬鈴薯淀粉含量較低，一般在12%-20%，這可能與其淀粉合成和降解過程有關(guān)。淀粉有直鏈淀粉（Amylose）和支鏈淀粉（Amylopectin），其中直鏈淀粉由1 000-6 000全葡萄糖殘基通過1，4-α糖苷鍵相連而成，分子量從幾千至百萬，微溶于熱水；其余為支鏈淀粉，由連接在1，6-α糖苷鍵分支點上的25-30個葡萄糖殘基以1，4-α糖苷鍵連接的1-10萬個葡萄糖鏈組成，分子量超過百萬，只能在熱2008水中膨脹形成穩(wěn)定的膠體。馬鈴薯淀粉黏性大、質(zhì)地細(xì)膩、白色有光澤、糊化溫度低、成膜性好，特別是直鏈淀粉與支鏈淀粉之比遠(yuǎn)大于玉米、小麥等禾谷類作物的淀粉比例，但吸水性差。一般中晚熟品種淀粉含量更高。馬鈴薯淀粉合成與降解的基因克隆對馬鈴薯品種遺傳改良和貯藏具有重要意義。本文總結(jié)了馬鈴薯淀粉合成與降解的研究進(jìn)展，并提出今后研究建議，以期為深入開展馬鈴薯淀粉改良工程研究提供參考。

1 馬鈴薯淀粉合成

淀粉有轉(zhuǎn)運淀粉和貯藏淀粉兩種存在形式。轉(zhuǎn)運淀粉是馬鈴薯葉片通過光合作用在葉綠體中合成的臨時儲備碳源，可以長距離運輸?shù)街参锏钠渌课?，而貯藏淀粉多貯藏于淀粉體中，作為塊莖發(fā)芽時的營養(yǎng)物質(zhì)。與淀粉合成的相關(guān)酶包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）和淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）［1］（圖 1）。目前，馬鈴薯中已鑒定的與淀粉合成相關(guān)基因，見表1。

圖1 馬鈴薯淀粉合成與降解途徑

1.1 AGPase

AGPase（EC 2.7.7.27）是由2個大亞基和2個小亞基組成的異源四聚體，其作用主要是催化ATP與葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）生成ADP-葡萄糖（ADPG）并釋放出焦磷酸［2］。作為淀粉合成的限速酶，AGPase活性與小亞基有關(guān)，大亞基主要起調(diào)節(jié)作用，受晝夜周期和Pi調(diào)控［3］。馬鈴薯塊莖淀粉含量（Starch content，SC） 和 AGPase活 力（AGPase activity，AA）間呈顯著正相關(guān)（SC=2.47AA+5.45，R2=0.651）［4］。低溫貯藏條件下，AGPase活性與還原糖含量負(fù)相關(guān)［5］。

表1 目前馬鈴薯中鑒定的淀粉合成基因

1.2 淀粉合成酶

馬鈴薯淀粉合成酶（Starch synthase，SS）（EC 2.4.1.21）包括顆粒結(jié)合淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）和可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS），主要通過在ADPG上加葡萄糖催化α-1，4-葡聚糖鏈的延伸，其活性影響淀粉的直鏈淀粉/支鏈淀粉比例、淀粉鏈長及結(jié)構(gòu)等品質(zhì)［6］。馬鈴薯塊莖直鏈淀粉約占天然淀粉的20%-25%，主要與GBSS有關(guān)，GBSS主要存在于淀粉顆粒中，包括GBSSI和GBSSII。從馬鈴薯栽培種“東農(nóng)303”中克隆到5 428 bp的GBSS（包括5′和3′側(cè)翼區(qū)），并發(fā)現(xiàn)5′側(cè)翼區(qū)存在較多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)［7］。通過PCR技術(shù)從馬鈴薯品種“大西洋”中克隆了馬鈴薯GBSS基因5′側(cè)翼序列并證實其具有啟動基因表達(dá)功能［8］。從馬鈴薯栽培種“甘農(nóng)薯2號”中克隆到1 824 bp的GBSSI基因，雖然與其他植物同源性較低，但具有淀粉合成功能。宋東光等［9］在研究馬鈴薯GBSS基因5′側(cè)翼區(qū)調(diào)控作用時，發(fā)現(xiàn)1.6 kb、2.9 kb GBSS-GUS的表達(dá)最高，蔗糖可誘導(dǎo)GBSS-GUS的表達(dá)，而光抑制其表達(dá)。SSS存在于造粉體的可溶性基質(zhì)中，可分為SSI、SSII和SSIII三種，但馬鈴薯塊莖中只有SSII和SSIII兩種，其中SSIII占80%的酶活性［10］。用RT-PCR方法從“隴薯3號”中克隆了3 967 bp的SSIII基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析［11］。

1.3 淀粉分支酶

淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）（EC 2.4.1.18）可分為SBEI、SBEIIa和SBEIIb三種，主要在ADPG線性鏈間引入α-1，6-糖苷鍵形成分支結(jié)構(gòu)。SBEI和SBEIIb主要存在于胚乳中，SBEIIa存在于葉片中。

1.4 淀粉去分支酶

淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）有異淀粉酶（Isoamylase，ISA）和限制性糊精酶（Pullulanase，RE）兩種，主要對分支鏈進(jìn)行修飾并合成具有一定結(jié)構(gòu)特性的淀粉結(jié)晶體［12］。SBE和DBE之間的活性平衡決定支鏈淀粉的最終分支程度，當(dāng)SBE 活性增強時，該平衡向PG方向移動；當(dāng)DBE活性增強時，該平衡向支鏈淀粉方向移動［13］。

2 馬鈴薯淀粉降解

淀粉可以在糖酶（淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、纖維素酶和果膠酶等）作用下水解為紅糊精、無色糊精、麥芽糖和葡萄糖。馬鈴薯常低溫貯藏，容易發(fā)生糖化，導(dǎo)致還原糖積累。為了減少低溫糖化帶來的損失，除了要增強碳水化合物從己糖到淀粉的流動，還要阻止蔗糖和淀粉水解成還原糖。淀粉降解可以通過淀粉磷酸化途徑和淀粉水解途徑（圖1），其過程包括可溶性葡聚糖的釋放、可溶性和線性葡聚糖的代謝和麥芽糖代謝3個階段。葡聚糖水雙激酶（Glucan water dikinase，GWD）和磷酸葡聚糖水雙激酶（Phosphoglucan water dikinase，PWD）可以磷酸化葡聚糖，降解淀粉［24］。淀粉磷酸酶（EC 2.4.1.1）也參與淀粉磷酸化途徑。水解途徑主要涉及 α-amylase（Amy，EC 3.2.1.1）和 β-amylase（BAM，EC 3.2.1.2）［25］。

2.1 淀粉酶

淀粉酶有兩種：α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶有3個亞家族，分別位于胚乳、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，可以特異切斷α-1，4-糖苷鍵，生成寡糖。擬南芥有3個α-淀粉酶，只有擁有葉綠體轉(zhuǎn)運肽的AtAMY3具有α-淀粉酶活性［26］。β-淀粉酶可以從多聚糖非還原性末端切斷α-1，4-糖苷鍵，生成麥芽糖。擬南芥有9個β-淀粉酶，不同淀粉酶亞型的亞細(xì)胞定位和功能也不一樣［27］。利用基因芯片從馬鈴薯塊莖中篩選到低溫響應(yīng)的StBMY7和PCT-BMY1［28］。馬鈴薯α-淀粉酶活性主要由StAmy23引起，β-淀粉酶活性主要由StBAM1和StBAM7引起，冷藏塊莖中的淀粉酶抑制劑可以調(diào)節(jié)淀粉酶的活性［29］。

2.2 淀粉磷酸激酶

GWD是催化ATP上的磷酸鹽向支鏈淀粉葡萄糖基C3或C6位轉(zhuǎn)移。PWD可對C3位置的葡萄糖基單元進(jìn)行磷酸化［30］。馬鈴薯淀粉磷酸化約35%發(fā)生在葡萄糖基C3位置上，65%是在C6位置上。GWD和PWD對淀粉粒的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)有不同的影響。

2.3 轉(zhuǎn)化酶

轉(zhuǎn)化酶（b-fructofuranosidaes，EC 3.2.1.26）可以將蔗糖不可逆水解成葡萄糖和果糖，根據(jù)最適pH可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（Acid invertase，AI）和中/堿性轉(zhuǎn)化酶（Neutral/alkaline invertase，NI），AI存在于細(xì)胞壁和液泡，NI位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體。馬鈴薯有6個酸性轉(zhuǎn)化酶基因，4個定位于細(xì)胞壁，2個定位于液泡，其中StvacINV1表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，是造成馬鈴薯塊莖低溫糖化的主要原因［31］。

3 馬鈴薯淀粉特性改進(jìn)

為了有效改良馬鈴薯淀粉品質(zhì)，可以深入研究馬鈴薯淀粉合成酶基因功能并采用基因工程技術(shù)來改進(jìn)淀粉特性（表2）。在增加淀粉含量方面，轉(zhuǎn)glgC16（大腸桿菌AGPase基因）表達(dá)提高了馬鈴薯AGPase酶活性，增加了塊莖淀粉含量［32］。過表達(dá)ATP/ADP轉(zhuǎn)運子提高馬鈴薯塊莖淀粉，而RNA干擾ATP/ADP轉(zhuǎn)運子則降低淀粉含量［33］。超量表達(dá)sAGP（AGPase小亞基基因）提高了馬鈴薯AGPase酶活性，增加塊莖淀粉，降低的還原糖含量，能有效改善馬鈴薯的加工品質(zhì)［34］。轉(zhuǎn)AGPase基因改變了馬鈴薯淀粉在不同溶劑和不同鹽溶液中的特性黏度［35］。與對照相比，轉(zhuǎn)AGPase馬鈴薯株系的AGPase活力、葉片光合速率和塊莖淀粉含量顯著提高，說明AGPase可反饋調(diào)控上游光合速率［4］。降低GWD的表達(dá)可以推遲冷藏轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖的還原糖積累［36］。通過RNA干擾馬鈴薯Amy23和BAM1表達(dá)可以降低還原糖含量［37］。將反義GBSSI和雙拷貝glgC融合基因?qū)胍吧婉R鈴薯可以顯著增加淀粉含量［38］。反義AGPase基因抑制AGPase酶活性，馬鈴薯塊莖中只有糖而無淀粉［39］。把AGPase反義基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，降低了AGPase酶活性和淀粉產(chǎn)量［40］。反義RNA技術(shù)干涉馬鈴薯BMY1表達(dá)降低轉(zhuǎn)基因株系葉片淀粉含量［41］。

在淀粉改性方面，降低馬鈴薯ISA1/ISA2表達(dá)可以增加塊芭中可溶性葡聚糖含量［42］。同時抑制ISA1/ISA2/ISA3表達(dá)也會升高塊莖葡聚糖含量［43］。用反義RNA技術(shù)抑制GBSSI基因表達(dá)可以使馬鈴薯喪失直鏈淀粉合成能力［44］。抑制GBSSI基因表達(dá)，可以大幅降低直鏈淀粉含量，從而增加支鏈淀粉［45］。AGPase基因不僅影響淀粉含量也改變淀粉的組成［46］。反義技術(shù)可以增加SSSIII基因表達(dá)［47］。反義抑制SSSIII基因表達(dá)，降低支鏈淀粉含量，改變淀粉結(jié)構(gòu)和淀粉粒形態(tài)［48］。SBE也影響支鏈淀粉的合成、分子結(jié)構(gòu)和淀粉粒形態(tài)［49］。

在改變淀粉組分方面，反義抑制SSIII表達(dá)可以改變馬鈴薯淀粉顆粒形態(tài)和磷酸含量［19］。通過抑制3種馬鈴薯淀粉合成酶基因可獲得短支鏈淀粉［22］。反義抑制StGBSSI表達(dá)可以影響四倍體馬鈴薯淀粉組成［50］。構(gòu)建GBSSI基因的ihpRNAi載體并轉(zhuǎn)入馬鈴薯可以顯著提高支鏈淀粉含量［51］。杜宏輝等［52］以馬鈴薯栽培種“克新1號”和“克新4號”為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)SSIII基因的馬鈴薯植株，為馬鈴薯淀粉品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。RNAi技術(shù)抑制馬鈴薯Sbe1和Sbe2a基因可獲得直鏈淀粉含量高的馬鈴薯植株并提高凍融穩(wěn)定性［53］。超量表達(dá)GWD對馬鈴薯淀粉粒形態(tài)結(jié)構(gòu)、直鏈淀粉含量、糊化作用等有顯著影響［54］。

4 展望

馬鈴薯塊莖淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，兩者都含有葡萄糖但大小形態(tài)不同［55］。淀粉合成與降解過程決定最終的淀粉含量，馬鈴薯淀粉合成與降解基因克隆對馬鈴薯品種遺傳改良具有重要意義，目前部分克隆的馬鈴薯淀粉合成與降解基因已在增加馬鈴薯淀粉含量、淀粉改性和改變淀粉組分方面得到廣泛應(yīng)用。為了提高馬鈴薯塊莖淀粉含量和培育特色馬鈴薯品種，今后要著力于做好以下幾項工作：一是要加快鈴薯淀粉合成與降解相關(guān)基因的克隆與功能鑒定，分析淀粉代謝關(guān)鍵基因啟動子序列調(diào)控元件，闡明關(guān)鍵基因功能和酶活性的調(diào)節(jié)機制，弄清楚控制馬鈴薯淀粉結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，為深入開展馬鈴薯淀粉改良工程研究提供參考。二是要加強馬鈴薯轉(zhuǎn)基因技術(shù)、RNAi技術(shù)和基因組編輯技術(shù)研究，特別是啟動子的選擇，選育出抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯新品種，使之更好地服務(wù)生產(chǎn)。馬鈴薯塊莖特異性啟動子主要有patatin基因啟動子和GBSS基因啟動子［56］，選擇適合的啟動子可以更有效地調(diào)控馬鈴薯塊莖中淀粉合成酶基因的表達(dá)。利用CRISPR技術(shù)獲得Inv基因敲除等位基因的馬鈴薯品系，其冷藏塊莖中還原糖含量和丙烯酰胺含量顯著低于野生型［57］。三是根據(jù)基因功能和定位，發(fā)展一批可用于改良馬鈴薯的基因標(biāo)記或候選基因。使用關(guān)聯(lián)作圖方法發(fā)現(xiàn)了GWD、SBEI、SSIII和SBEII的等位基因變異，可以作為與馬鈴薯淀粉磷酸化程度相關(guān)的遺傳標(biāo)記［58］。四是深入研究農(nóng)藝措施對馬鈴薯塊莖淀粉含量的影響，闡明其作用機理。增施氮素和鉀肥可以提高馬鈴薯塊莖的AGPase和淀粉合成酶的活性，相反，遮陰處理顯著降低淀粉合成關(guān)鍵酶的活性。

表2 馬鈴薯轉(zhuǎn)淀粉相關(guān)基因研究