基于掃描電化學(xué)顯微鏡技術(shù)研究細(xì)胞實時釋放ROS

樊孝銀，魯理平，康天放

(北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院,北京 100124)

活性氧物種(Reactive oxygen species,ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，包括：O2·-，HOO·，OH·，H2O2等[1-2]，在正常生理條件下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生處于動態(tài)平衡狀態(tài)[3]。然而，當(dāng)動態(tài)平衡被打破時會造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生[4-5]，而且ROS的強氧化性可以引起細(xì)胞廣泛的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。目前檢測細(xì)胞ROS產(chǎn)生的方法有熒光測定法[7]、電子自旋共振法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9]和流式細(xì)胞儀法[10]等。但這些方法均存在不能實時檢測活細(xì)胞中ROS的不足，如廣泛使用的試劑盒方法(熒光測定法)存在對細(xì)胞浸入的潛在傷害作用，以及部分方法操作復(fù)雜等缺點。因此發(fā)展生理條件下檢測細(xì)胞膜中實時釋放ROS的分析技術(shù)對于探究生命體系受外界影響的機制至關(guān)重要。

佛波酯又稱為十四烷酰佛波醇乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)，是一種可通過激活蛋白激酶PKC和NOXs來影響眾多細(xì)胞生理過程的化合物。PMA是佛波酯類化合物中活性較高的一種，具有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化的作用，生物學(xué)研究表明PMA能夠誘發(fā)ROS的產(chǎn)生并觸發(fā)癌細(xì)胞的凋亡[11]。

掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)是由Bard等于1989年提出的利用超微電極掃描得到法拉第電流對微區(qū)進(jìn)行形貌以及電化學(xué)成像的一種顯微新技術(shù)[12-13]。SECM的關(guān)鍵要素是超微電極，具有顯著的靈敏度，短的響應(yīng)時間和高的空間分辨率。盡管SECM起源于電分析表面科學(xué)，但在生物學(xué)應(yīng)用和生物體研究方面也日益受到了人們關(guān)注。SECM在細(xì)胞研究中顯示出獨特的優(yōu)勢：①可無需探針-樣本的接觸即實現(xiàn)活體細(xì)胞直接檢測；②只對有電活性的物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，選擇性好；③單個細(xì)胞的表面形貌和局部反應(yīng)可在高空間分辨率下進(jìn)行研究。因此SECM在細(xì)胞水平上的研究具有無損傷性的獨特優(yōu)勢[14-15]，適合研究活細(xì)胞中ROS的釋放?；诮陙鞸ECM的發(fā)展及獨特優(yōu)勢，其在單細(xì)胞分析上的應(yīng)用也十分廣泛[16-19]，利用不同的操作模式，可以分析細(xì)胞多個特征，尤其是SECM電流信號的變化能夠反映細(xì)胞對外界刺激的變化，這為SECM在細(xì)胞水平上研究環(huán)境污染物的作用，以及環(huán)境毒理分析奠定了良好的基礎(chǔ)，并對明確污染物產(chǎn)生的生物毒性機理提供了一定的依據(jù)。本研究利用ROS的穩(wěn)定產(chǎn)物——H2O2具有電活性的特點，比較了PMA對肺癌細(xì)胞(A549)即時刺激前后ROS的變化，并通過SECM成像技術(shù)原位實時檢測了PMA誘導(dǎo)A549細(xì)胞ROS的釋放。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

掃描電化學(xué)顯微鏡CHI920D(SECM，上海辰華儀器有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯CKX41)，鉑超微電極/探針(直徑：10 μm)，鉑絲對電極，Ag/AgCl參比電極(上海辰華儀器有限公司)；氯化六氨基合釕(Ru(NH3)6Cl3，美國Sigma公司)，1×PBS(上海生工生物科技有限公司)，過氧化氫(H2O2，30%)，十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA)，二甲基亞砜(DMSO)購于北京化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為超純水(1 018 Ω，美國Milli-Q超純水系統(tǒng))；A549細(xì)胞(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程實驗室);RPM 1640 培養(yǎng)基：4 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r加入1% 2 mmol/L的谷氨酰胺和10%的胎牛血清;PBS緩沖液、胰酶(美國Invitrogen公司);Opti-MEMI減血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

(1)將A549細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，迅速放入 37 ℃水浴中，期間需晃動凍存管使其充分融化，直至凍存管中的物質(zhì)基本融化。

(2)在超凈工作臺，向 15 mL 離心管中加入 5 mL RPM 1640 培養(yǎng)基，將凍存管中的液體(1 mL)加入 15 mL 離心管中，800 r/min 離心 5 min，離心管底部可見白色沉淀。

(3)棄去上層液體，向離心管中加入 5 mL 1640 培養(yǎng)基，用移液器吹打混勻，轉(zhuǎn)移至35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入 37 ℃的 CO2(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(4)細(xì)胞生長 24 h 后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。將培養(yǎng)好的細(xì)胞用于SECM實驗。

1.3 SECM實驗

將SECM與倒置顯微鏡結(jié)合，檢測A549細(xì)胞釋放ROS的示意圖如圖1所示。10 μm Pt超微電極電位設(shè)定為 -0.35 V，在含有Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中做逼近曲線確定探針與基底間的距離，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，在恒高模式下對細(xì)胞進(jìn)行SECM的二維成像，掃描速度為50 μm/s。設(shè)置探針電位為 -0.65 V，在不含Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中并保持氮氣氣氛條件下檢測ROS，利用SECM檢測細(xì)胞的反饋電流，并進(jìn)行二維成像掃描。

圖1 SECM檢測細(xì)胞外ROS的示意圖Fig.1 Schematic representation of SECM for detection of extracellular ROS parameter：in a nitrogen-purged 1×PBS solution,10 μm Pt ultramicroelectrode, potential: -0.65 V

圖2 空白基底上的SECM逼近曲線(黑色)與SECM擬合逼近曲線(紅色)Fig.2 SECM experimental approach curves on dish (black)compared to simulated approach curves(red) parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential:-0.35 V

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞原位成像

細(xì)胞內(nèi)的ROS通常由細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生[6]，通過檢測細(xì)胞外的ROS可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放，避免了探針對細(xì)胞造成的機械損傷。獲取信號的探針與細(xì)胞之間的距離對于信號的靈敏采集至關(guān)重要。因此首先利用逼近曲線確定探針的空間位置，將盛有A549細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡載物臺上，探針選擇性的放置在無細(xì)胞的培養(yǎng)皿區(qū)域上方，并浸入含有1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液，施加 -0.35 V(vs.Ag/AgCl，Ru(NH3)6Cl3的還原電位)電位。探針尖端沿著垂直于水平方向逼近培養(yǎng)皿底部，在電極電流降低至I=0.75I∞時，停止逼近，獲得探針的空間高度。如圖2所示，所得結(jié)果顯示電流響應(yīng)為負(fù)反饋模式[12,20]。圖中黑實線為實驗得到的逼近曲線，紅色虛線為模擬曲線，實驗中探針電極的RG比為3。根據(jù)表格中參數(shù)以及公式(1)、(3)計算理論逼近曲線，式中，IT為探針尖端電流，IT,∞為探針離基底無窮遠(yuǎn)處時探針尖端的電流，a為UME探針尖端半徑，d為探針-基底距離，do為從掃描第一點到基底表面的距離，dexp為探針距逼近起始點的距離。其中公式(3)的參數(shù)參照表1[21]。將實驗所得的數(shù)據(jù)值繪制為I/I∞與L的函數(shù)并重疊理論逼近曲線，比較和分析差異。更改do值，直至找到實際曲線和擬合曲線間的良好擬合。如圖2，結(jié)合實驗與模擬曲線擬合結(jié)果[21]，計算出探針尖端與基底間的實際距離d約8 μm。將此位置確定為探針與基底表面之間的檢測距離[21]。

IT→I=IT/IT,∞

(1)

dexp→L=d/a=(do-dexp)/a

(2)

I=1/[A+B/L+Cexp(D/L)]

(3)

表1 不同RG值下等式(3)(負(fù)反饋)的參數(shù)值Table 1 Parameter values for equation(3)(negative feedback)at different RG values

圖3 A549細(xì)胞的SECM成像圖 Fig.3 SECM image of A549 cells parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential: -0.35 V

其后通過顯微鏡觀察，將探針?biāo)蕉ㄎ恢良?xì)胞區(qū)域上方，探針電位設(shè)置為-0.35 V，在含有1 mmol/L(Ru(NH3)6Cl3)的1×PBS溶液中，保持檢測距離8 μm，通過SECM的恒高模式對細(xì)胞進(jìn)行二維掃描成像。獲得的SECM圖像如圖3所示，圖中水平范圍為80×80 μm，不同顏色表示所得到的電流大小不同。從上部的二維圖像可明顯看出掃描區(qū)域內(nèi)有3個橢圓形的細(xì)胞(坐標(biāo)X/Y：33～57/13～38)、(坐標(biāo)X/Y：20～43/36～65)、(坐標(biāo)X/Y：42～80/ 65～80)，依次呈綠色、黃色和紅色，表示所測得的反饋電流逐步增大，結(jié)合下方的三維圖像可知細(xì)胞的形貌接近橄欖球體。通過測定反饋電流大小得到細(xì)胞形貌的原理是因為親水性物質(zhì)Ru(NH3)6Cl3不能穿透疏水性細(xì)胞膜[22]，細(xì)胞表面為電化學(xué)惰性底物，細(xì)胞與探針頂端之間的極小空間阻礙了Ru(NH3)6Cl3向探針的擴散，且細(xì)胞具有一定的高度，導(dǎo)致電流降低。因此，在二維掃描期間IT的減少歸因于探針與細(xì)胞距離的減小，也對應(yīng)于細(xì)胞高度的增加。

圖4 不同濃度H2O2的差分脈沖伏安曲線Fig.4 DPV curves of different concentration of H2O2cH2O2(a-c):0,2,4 mmol/L；detection system：1×PBS solution after deoxygenation

2.2 檢測條件的優(yōu)化

探針電位的準(zhǔn)確設(shè)置對于ROS檢測的靈敏度至關(guān)重要。為了優(yōu)化本體系檢測ROS探針的施加電位，利用差分脈沖伏安法(DPV)獲得不同濃度H2O2的電化學(xué)響應(yīng)，檢測介質(zhì)為通氮除氧處理的1×PBS溶液，且檢測過程保證氮氣氛圍，所得結(jié)果如圖4所示。圖中可觀察到，未加入H2O2時體系所測的DPV曲線無電化學(xué)響應(yīng)(曲線a)；依次對含2 mmol/L和4 mmol/L H2O2的體系進(jìn)行DPV掃描(曲線b、c)，可觀察到在-0.65 V處有1個明顯還原峰，且隨著濃度增大，還原峰電流增強。通過與文獻(xiàn)比對[22]，確定此峰為H2O2的還原峰。因此，最終確定SECM實驗中探針電位設(shè)為-0.65 V。

在上述優(yōu)化實驗條件下，利用SECM探針收集模式檢測了原態(tài)細(xì)胞中ROS的釋放。探針電位設(shè)定為-0.65 V，探針位置在逼近處垂直下降4 μm。通過顯微鏡觀察，確定探針位置處于細(xì)胞上方，檢測體系為1×PBS 溶液(此時體系中無Ru(NH3)6Cl3)，掃描范圍為80×80 μm，得到了細(xì)胞ROS釋放的背景圖像。如圖5所示，可看出局部電流未出現(xiàn)顯著變化，說明此時A549細(xì)胞的ROS釋放處于平衡狀態(tài)。

圖5 無刺激狀態(tài)下A549細(xì)胞的SECM成像圖Fig.5 SECM image of A549 cells without stimulation parameter：in a nitrogen-purged 1×PBS solution,10 μm Pt ultramicroelectrode, potential: -0.65 V

2.3 A549細(xì)胞的ROS的實時檢測

圖6 0.25 μg/mL PMA處理A549細(xì)胞后，SECM對細(xì)胞的成像圖Fig.6 SECM image of A549 cells after treatment of 0.25 μg/mL PMA parameter:in a nitrogen-purged 1×PBS solution at -0.65 V,image:80×80 μm

圖7 0.25 μg/mL PMA處理A549細(xì)胞后，SECM對細(xì)胞的成像圖Fig.7 SECM image of A549 cells after treatment of 0.25 μg/mL PMA parameter: in a nitrogen-purged 1×PBS solution at -0.65 V,image:100×100 μm

圖8 探針位于A549細(xì)胞垂直上方I-t曲線Fig.8 I-t curve of ROS from the A549 cell parameter:in a nitrogen-purged 1×PBS solution contain 0.25 μg/ml PMA at -0.65 V;10 μm Pt ultramicroelectrode was moving down 4 μm from the approach site

SECM技術(shù)是直接捕捉電子的轉(zhuǎn)移而獲得電信號，所以利用SECM檢測細(xì)胞中ROS的釋放具有實時、靈敏的特點。在優(yōu)化實驗條件下，采用SECM技術(shù)考察了PMA刺激A549細(xì)胞時的實時氧化應(yīng)激響應(yīng)(ROS)，實驗條件為：檢測體系為通氮除氧的1×PBS溶液(不含有其它氧化還原物質(zhì))，檢測過程保證氮氣氛圍，探針電壓為-0.65 V，探針位置為逼近處垂直下降4 μm，即時加入的PMA濃度為0.25 μg/mL[23]。圖6所示為對應(yīng)的二維和三維成像圖，可觀察到在掃描區(qū)域內(nèi)(坐標(biāo)：X/Y：22～45/10～57)出現(xiàn)1個細(xì)胞的明顯圖像(此細(xì)胞標(biāo)記為A細(xì)胞)。且在細(xì)胞的不同局部出現(xiàn)了電流負(fù)反饋和電流正反饋的不同現(xiàn)象。根據(jù)基底產(chǎn)生-探針收集模式[24]推測其電流變化(坐標(biāo)X/Y：22～45 /10～22)的原因為：對于此檢測體系中探針測得的電流(IT)主要來自細(xì)胞釋放的ROS物質(zhì)及痕量溶解氧。當(dāng)加入0.25 μg/mL PMA刺激細(xì)胞后，觀察到坐標(biāo)(X/Y：22～45/10～22)處電流呈現(xiàn)負(fù)反饋，這是因為在探針頂端和細(xì)胞表面的狹小空間內(nèi)，在無ROS產(chǎn)生的細(xì)胞局部，電流只來自于細(xì)胞呼吸消耗后剩余的痕量溶解氧，在此處探針檢測的電流(IT)由于溶解氧的有限擴散而降低；同時在區(qū)域(坐標(biāo)X/Y：22～45/22～57)電流產(chǎn)生正反饋的原因是由于細(xì)胞的另一局部因PMA的刺激產(chǎn)生了大量的ROS，且ROS電流的增加大于背景溶解氧的消耗，探針檢測的電流(IT)隨ROS的增加而增大，此時這一位置推測為線粒體亞細(xì)胞器[17]。

為了獲取PMA刺激對A549細(xì)胞ROS釋放的更多信息，采用在較大掃描范圍(100×100 μm)對多個細(xì)胞釋放ROS的過程進(jìn)行實時檢測。在掃描區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)3個完整的細(xì)胞圖像(如圖7)。對應(yīng)圖6的A細(xì)胞出現(xiàn)在坐標(biāo)(X/Y：17～46/56～98)處，仍然顯現(xiàn)出部分負(fù)反饋的另一部分正反饋的現(xiàn)象；位于坐標(biāo)(X/Y：41～65/14～51)處的B細(xì)胞，顯現(xiàn)出兩部分的正反饋電流，但電流明顯小于A細(xì)胞的正反饋電流值(IA=8.364×10-10A ;IB=7.276×10-10A)；位于坐標(biāo)(X/Y：11～28/13～53)處的C細(xì)胞，也顯現(xiàn)出兩部分的正反饋電流，但電流明顯大于A細(xì)胞的正反饋電流值(IA=8.364×10-10A ;IC=9.805×10-10A)。3個細(xì)胞均檢測到不同釋放量的ROS。由于細(xì)胞的異質(zhì)性，在電位-0.65 V下，不同細(xì)胞個體測得的電流大小不同，說明不同細(xì)胞釋放ROS的量也不同，其原因可能是細(xì)胞具有不同的狀態(tài)或處于不同的生長周期所致。

為了進(jìn)一步考察細(xì)胞ROS釋放的實時動態(tài)過程，將探針電位設(shè)置為-0.65 V，探針位置恒定在距離C細(xì)胞上方，位置為逼近處垂直下降4 μm，考察了電流隨時間的變化。結(jié)果如圖8所示，從圖中可以看出，在檢測期間(320 s內(nèi))，電流隨時間的變化呈波動狀態(tài)，其波動范圍平均在每30 s內(nèi)電流變化4 pA，說明細(xì)胞釋放ROS的過程為一個脈動過程，且具有一定的規(guī)律性，推測與一定的生命活動相關(guān)。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)展了一種利用SECM技術(shù)檢測細(xì)胞對外界刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的簡便有效方法。以A549細(xì)胞外的H2O2作為測定目標(biāo)物，在不添加任何標(biāo)記物的情況下，利用SECM實現(xiàn)了無侵害性地對細(xì)胞形貌以及細(xì)胞對外界刺激后產(chǎn)生ROS的實時檢測。利用SECM掃描成像的特點實時捕捉ROS的釋放，得到由于細(xì)胞異質(zhì)性的特點，不同個體細(xì)胞在相同刺激環(huán)境的條件下產(chǎn)生了不同的氧化應(yīng)激響應(yīng)，顯示出SECM檢測ROS具有靈敏、實時、清晰的獨特優(yōu)點。這一SECM檢測平臺的建立將在環(huán)境污染物等外界化學(xué)物對生命體系的健康影響研究中發(fā)揮更大的作用。

致謝:非常感謝南密西西比大學(xué)(美國)繆五建教授給予的切實幫助和有益討論。