張 帆，張 瑩，黃志強(qiáng)，白 珊，席 慧，蔡青云

(1.長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

茶油是世界四大木本糧油之一，其富含人體必需的不飽和脂肪酸、維生素E等生物活性成分，營(yíng)養(yǎng)保健功能極高，因此被稱(chēng)為“東方橄欖油”和“油中軟黃金”[1-3]。隨著茶油消費(fèi)量的逐年提升，在油茶的大量種植過(guò)程中，農(nóng)藥的不當(dāng)使用可能會(huì)污染環(huán)境，易使人畜發(fā)生中毒事件[4-5]。氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥作為殺蟲(chóng)劑、殺菌劑和除草劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的保護(hù)，具有高效、選擇性強(qiáng)、分解快、殘效期短等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[6]。特別是高毒的克百威及涕滅威的濫用，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生極大危害，其降解的代謝產(chǎn)物半衰期長(zhǎng)，且環(huán)境毒性比母體更強(qiáng)[7-8]。我國(guó)作為植物油消費(fèi)大國(guó)，植物油的質(zhì)量安全與人民健康和貿(mào)易增長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系[9]。因此，我國(guó)GB 2763-2016標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食用植物油及油料作物中多種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留限量作了明確規(guī)定[10-11]。

目前關(guān)于食用油中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究主要側(cè)重于樣品前處理，多采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化、商業(yè)固相萃取小柱(SPE)凈化等[12-15]傳統(tǒng)方法。GPC是目前針對(duì)高脂肪含量樣品的先進(jìn)方法，但該儀器較為昂貴，有機(jī)試劑用量大，且處理時(shí)間較長(zhǎng)[16];而固相萃取小柱多為一次性使用，且價(jià)格較高。多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種高效、廉價(jià)的固相萃取吸附劑，憑借其較強(qiáng)的表面吸附作用被越來(lái)越多地應(yīng)用于樣品的富集和凈化[17-21]。目前，MWCNTs固相萃取小柱用于茶油中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將MWCNTs固相萃取小柱用于茶油樣品凈化，能夠有效降低茶油中脂肪等大分子雜質(zhì)的干擾，該小柱經(jīng)甲苯溶液處理后，可重復(fù)利用，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)進(jìn)行測(cè)定，建立了一種高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的茶油中12種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

1.2 儀器設(shè)備

LCMS-8040超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配ESI源(日本島津公司)；XS20電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；SA300振蕩器(日本大和科學(xué)株式會(huì)社)； SB-5200DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Universal320 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)海蒂詩(shī)公司)；固相萃取裝置(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；RE600旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Yamato公司)；Milli-Q去離子水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)。

1.3 MWCNTs SPE柱的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取75 mg MWCNTs填料置于6 mL塑料固相萃取空柱管中，用篩板固定填料，使固相萃取小柱中填料的裝填高度保持在0.3 cm左右。

1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱(chēng)取12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg(精確至0.000 1 g)于12個(gè)10 mL容量瓶中，加少量乙腈振蕩溶解后，以乙腈定容，配制成1.0 mg/mL的12種農(nóng)藥單標(biāo)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。以0.1%乙酸-乙腈(5∶5，體積比)進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥?.005、0.01、0.02、0.05、0.1 μg/mL的12種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取茶油樣品2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞聚四氟乙烯離心管中，向離心管中加入10 mL乙腈，置于振蕩器上充分振蕩混勻5 min，超聲提取10 min，將離心管置于-20 ℃冷凍離心機(jī)中，以8 000 r/min冷凍離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，下層殘?jiān)儆?0 mL乙腈提取1次，冷凍離心10 min，合并兩次上清液，混勻后取10 mL至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃濃縮至約2 mL，待凈化。

1.5.2 固相萃取凈化在MWCNTs 固相萃取小柱上端裝入1 cm高的無(wú)水硫酸鈉，先用6 mL乙腈預(yù)淋洗小柱，棄去淋洗液。將待凈化的茶油提取液完全轉(zhuǎn)移至萃取小柱中，用15 mL離心管收集流出液，直至提取液完全通過(guò)該柱。用8 mL乙腈進(jìn)行洗脫，控制流速為0.5 mL/min，收集所有流出液。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃濃縮至近干，用0.1%乙酸-乙腈(5∶5)定容至1.0 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后，待測(cè)定。

1.6 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱:Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)。流動(dòng)相：A為0.1%乙酸，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5 min，10%～40%B；5～10 min，40%～85%B；10～10.5 min，85%～10%B；10.5～14 min,10%B；流速：0.4 mL/min。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；駐留時(shí)間：100 s；離子源接口電壓：3.5 kV；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣：氮?dú)?，流?.0 mL/min；干燥氣：氮?dú)?，流?5 mL/min；碰撞氣：氬氣，純度99.999%；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 12種氨基甲酸酯農(nóng)藥的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring of 12 carbamate pesticides

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的選擇

比較了振蕩提取和超聲提取兩種方法對(duì)茶油中12種農(nóng)藥的回收率。準(zhǔn)確稱(chēng)取4份空白茶油樣品各2.0 g，分別添加0.02 mL 5 μg/mL的12種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”進(jìn)行樣品前處理，其中振蕩提取法提取時(shí)間為15 min，超聲提取法提取時(shí)間為 10 min，超聲功率為180 W，每種方法平行2次。結(jié)果顯示，超聲提取法對(duì)茶油中12種農(nóng)藥的提取回收率略高于振蕩提取法，這主要是由于超聲波對(duì)樣品的滲透力更強(qiáng)，提取效率更高。故實(shí)驗(yàn)最終選擇超聲提取法。

2.2 凈化材料的選擇

比較了分別填裝70 mg 氧化石墨烯(GO)、MWCNTs固相萃取小柱和商業(yè)C18固相萃取小柱對(duì)茶油中12種農(nóng)藥的吸附凈化效果，在6支50 mL試管中各加入2.0 g空白茶油樣品，并按0.05 μg/g 加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”處理后采用本方法測(cè)定，平行2次。如圖1所示，GO小柱對(duì)12種農(nóng)藥的吸附性很強(qiáng)，其中滅害威、抗蚜威基本無(wú)回收，涕滅威的回收率很低。MWCNTs小柱和C18小柱的回收率均較理想，但C18小柱的凈化效果略差，譜圖中有很多雜峰，而MWCNTs小柱經(jīng)甲苯溶液處理后可重復(fù)利用，所以實(shí)驗(yàn)選擇MWCNTs作為凈化材料。

圖1 不同固相萃取小柱對(duì)12種氨基甲酸酯農(nóng)藥回收率的影響Fig.1 Effect of different SPE columns on recoveries of 12 carbamate pesticides

2.3 多壁碳納米管的選擇

考察了4種不同類(lèi)型MWCNTs的凈化能力，分別取70 mg MWCNT-1、MWCNT-2、MWCNT-3、MWCNT-4填充成固相萃取小柱，對(duì)加標(biāo)量為0.05 μg/g的空白茶油樣品按照“1.5”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取兩次測(cè)定結(jié)果的平均值。結(jié)果表明，MWCNT-1由于其較大的比表面積和較強(qiáng)的吸附性等特點(diǎn)，對(duì)茶油樣品的凈化能力最強(qiáng)，12種農(nóng)藥均獲得較滿(mǎn)意的回收率。因此，選擇MWCNT-1為固相萃取的吸附劑。進(jìn)一步比較了多壁碳納米管的用量(25、50、75、100 mg)對(duì)回收率的影響，綜合考慮12種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的整體回收率，實(shí)驗(yàn)選擇MWCNT-1用量為75 mg。

2.4 洗脫溶劑體積的選擇

比較了洗脫溶劑乙腈的體積(2、4、6、8、10 mL)對(duì)添加0.01 mL 5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多壁碳納米管固相萃取小柱的洗脫效果。結(jié)果表明，隨著乙腈體積的增加，12種待測(cè)目標(biāo)物的回收率逐漸增大，當(dāng)乙腈體積大于6 mL時(shí)，絕大部分待測(cè)目標(biāo)物的回收率達(dá)到最大并保持穩(wěn)定。為保證所有目標(biāo)物均被洗脫下來(lái)，實(shí)驗(yàn)最終選擇洗脫溶劑乙腈的用量為8 mL。

圖2 12種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of 12 carbamate pesticides standard solution(0.1 mg/L) the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 色譜條件的優(yōu)化

比較了Shim-pack XR-ODS柱(3.0 mm×100 mm，2.2 μm)和 Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)兩種不同規(guī)格色譜柱的分離效果和載樣能力。結(jié)果顯示，Shim-pack XR-ODSⅢ柱由于填料粒徑小，耐受壓力高，可在8 min內(nèi)完成12種待測(cè)農(nóng)藥的有效分離，與Shim-pack XR-ODS柱相比大大縮短了樣品分析時(shí)間。因此實(shí)驗(yàn)選擇Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0 mm×50 mm，1.6 μm)，并對(duì)流動(dòng)相的梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。在“1.6”條件下，12種待測(cè)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/L)的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

2.6 線(xiàn)性范圍與定量下限

按照“1.4”配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，12種待測(cè)農(nóng)藥的響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。通過(guò)陰性茶油樣品加標(biāo)來(lái)確定12種農(nóng)藥的定量下限(LOQ)。由表2可知，12種待測(cè)農(nóng)藥均在0.005～0.1 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.998 88，LOQ為0.2～3.0 μg/kg。

2.7 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在陰性茶油樣品中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使得各茶油樣品中12種待測(cè)農(nóng)藥的含量分別為0.01、0.025、0.05 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣品，按照本方法進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，在3個(gè)加標(biāo)水平下12種農(nóng)藥的回收率為78.3%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.6%～12%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度可滿(mǎn)足茶油中上述農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求。

表2 12種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r),limits of quantitation(LOQs),recoveries and relative standard deviations of 12 carbamate pesticides(n=6)

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)隨機(jī)選購(gòu)的市售30 個(gè)茶油樣品進(jìn)行篩查，其中2 個(gè)茶油樣品中檢出克百威，殘留量未達(dá)到本方法的定量下限，其余28個(gè)樣品均未檢出上述12種農(nóng)藥殘留。

3 結(jié) 論

本研究將填充的多壁碳納米管小柱用于茶油的前處理凈化，并結(jié)合UPLC-MS/MS分析，建立了一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定茶油中12種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MWCNTs 固相萃取小柱凈化效果良好，有效降低了茶油中油脂等大分子的干擾，且可重復(fù)使用，大大降低了分析成本。12種待測(cè)農(nóng)藥的LOQ為0.2～3.0 μg/kg，回收率為78.3%～116%，RSD為 2.6%～12%。該方法操作簡(jiǎn)便、選擇性好、準(zhǔn)確度高,可作為茶油中多種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法。