紙芯片顯色法用于L-半胱氨酸的快速測(cè)定

張 劍，謝婷婷，楊玉瑩，劉春葉*，F(xiàn)rank A.GOMEZ，Wilson LEE，肖 倩

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021；2.加州州立大學(xué) 化學(xué)與生物化學(xué)系, 美國(guó) 洛杉磯 90001)

紙芯片是近年來備受關(guān)注的一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型微流控分析器件，是基于紙質(zhì)材料(如濾紙、色譜紙、硝化纖維膜等)制成的微流控芯片[1-2]，其不僅保留了傳統(tǒng)微流控芯片的微型化、自動(dòng)化和集成化的優(yōu)點(diǎn)，還結(jié)合了紙質(zhì)材料本身所具有的成本低廉、制作簡(jiǎn)便、可循環(huán)再生和生物相容性好等特性。目前，紙芯片已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生[3-5]、食品安全[6-8]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[9-11]等領(lǐng)域的實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，對(duì)貧困國(guó)家和偏遠(yuǎn)地區(qū)的個(gè)性化醫(yī)療和診斷的普及具有一定推動(dòng)作用。

含巰基類化合物如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hys)、谷胱甘肽(GSH)、膽堿等在生物體內(nèi)扮演著重要的角色，如人體液中Cys的含量大幅波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致帕金森、老年癡呆、嗜睡、水腫等疾病。因此，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確、快速、高選擇性地檢測(cè)血樣中巰基化合物的含量，對(duì)于生物化學(xué)研究及臨床診斷具有十分重要的意義[12-13]。目前，含巰基化合物的常用儀器檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[14]、紫外分光光度(UV)法[15-18]、熒光分光光度法[19]、電化學(xué)法[20]、原子吸收光譜法[21]、氨基酸分析儀[22]等，其中HPLC需對(duì)樣品進(jìn)行柱前或柱后衍生，且衍生步驟較為繁瑣；電化學(xué)法雖不需衍生，但因Cys具有不可逆氧化性質(zhì)，在檢測(cè)過程中易導(dǎo)致電極老化，且重現(xiàn)性差。基于紙芯片的檢測(cè)方法有比色法[19,23]、熒光法[24]、化學(xué)發(fā)光法[25]、表面增強(qiáng)拉曼法[26]、電化學(xué)檢測(cè)[27]等，比色法因無需輔助檢測(cè)設(shè)備，是目前紙芯片分析中最為直觀方便、簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法。本研究以5,5'-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作為顯色劑，優(yōu)化顯色反應(yīng)條件，建立了一種基于紙芯片的顯色法用于L-Cys的快速測(cè)定，并將其用于實(shí)際血清樣品的檢測(cè)，以探究含巰基類化合物的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ALC-210.4電子天平、PB-10 pH計(jì)(北京賽多利斯科技儀器有限公司)；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼克儀器有限公司)；TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；魅族MX4手機(jī)(800萬像素，魅族科技有限公司)；1號(hào)定性濾紙(英國(guó)Whatman公司)。

L-半胱氨酸(L-Cys)、DTNB(純度≥99.0%，北京索萊寶科技有限公司)；L-色氨酸(純度≥99.0%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；L-組氨酸(純度≥99.0%，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；L-丙氨酸(98.5%，天津市博迪化工有限公司)；D-苯丙氨酸、DL-谷氨酸(98.0%，上海晶純生化科技股份有限公司)；牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O(純度≥99.0%，成都市科龍化工試劑廠)；碳酸氫鈉(純度≥99.0%，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；淀粉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖、氯化鉀、氯化鈉、氯化銨(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；硫酸鈉、硫酸鋅、無水氯化鈣(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 檢測(cè)L-半胱氨酸的紙芯片結(jié)構(gòu)Fig.1 Paper chip structure for detecting L-Cys

圖2 L-半胱氨酸的檢測(cè)原理Fig.2 Detection principle of L-Cys

1.2.1 紙芯片的制作采用Inkscape 0.91軟件設(shè)計(jì)紙芯片結(jié)構(gòu)圖案(見圖1)，其中A為Cys樣品加載區(qū)，B為流體通道，C為顯色區(qū)域，D為顯色劑DTNB加載區(qū)，灰色邊緣是疏水圍堰，周圍為親水區(qū)域。A、C、D區(qū)域直徑分別為4、4、6 mm，B通道長(zhǎng)7 mm，寬2 mm。設(shè)計(jì)顯色區(qū)域C可較好地解決干燥過程中的顏色貼壁現(xiàn)象。將設(shè)計(jì)好的結(jié)構(gòu)圖案用Xerox Phaser 8400噴蠟打印機(jī)打印在Whatman 1號(hào)定性濾紙上，然后于176.7 ℃下熱壓2 min，使濾紙表面粘附的蠟加熱融化后滲入濾紙內(nèi)部，形成親水與疏水相間的通道網(wǎng)絡(luò)，取出后于室溫下冷卻。

1.2.2 紙芯片檢測(cè)原理用磷酸鹽緩沖溶液配制DTNB，在中性或偏堿性條件下，DTNB與Cys的巰基發(fā)生交換反應(yīng)，生成黃色的2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子(TNBA)(圖2)，其顏色強(qiáng)度和L-Cys的含量成正比。將6.0 μL待測(cè)L-Cys樣品滴加于A區(qū)域，再加入6.0 μL DTNB標(biāo)準(zhǔn)溶液至D區(qū)，2種溶液在毛細(xì)作用下相向移動(dòng)至顯色區(qū)C，相遇發(fā)生反應(yīng)并顯色，然后用手機(jī)拍照，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。拍照時(shí)將紙芯片置于臺(tái)燈下方，由于使用手機(jī)軟件CS掃描全能王進(jìn)行掃描，每次僅需拖動(dòng)邊框確定掃描區(qū)域，即可獲得和掃描儀類似效果，故拍照距離對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。然后利用Photoshop CC軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，在顯色區(qū)C區(qū)選擇5個(gè)相同大小的區(qū)域，分別讀取RGB通道(即紅、綠、藍(lán)三疊加通道)的顯示圖像亮度的平均值，進(jìn)行比色檢測(cè)。

1.2.3 紫外分光光度法(UV)取0.5 mLL-Cys溶液加入0.5 mL 4.0 mg/mL DTNB標(biāo)準(zhǔn)溶液中，搖勻，室溫反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定其紫外吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色條件的優(yōu)化

2.1.1 上樣量的影響同等條件下，為增加顯色強(qiáng)度，理論上應(yīng)加載較多的反應(yīng)試劑，但由于芯片尺寸限制，加載量不能過大。故本研究考察了上樣量(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 μL)對(duì)顯色效果的影響(圖3)。由圖3可見，當(dāng)上樣量為6.0 μL時(shí)，紙芯片測(cè)定區(qū)填充效果和顯色強(qiáng)度均達(dá)到最佳狀態(tài)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇6.0 μL為最佳上樣量。

圖3 上樣量對(duì)顯色強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of loading amount on color intensity

2.1.2 緩沖液pH值的影響DTNB在偏酸性溶液中較為穩(wěn)定，反應(yīng)產(chǎn)物在偏堿性條件下易離子化顯色，因此需考察緩沖液pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。固定其他實(shí)驗(yàn)條件，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制DTNB顯色液及L-Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了不同pH值(6.0、7.0、7.4、8.0、9.0)對(duì)顯色強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為7.4時(shí)體系顯色強(qiáng)度最大，故選擇pH 7.4的PBS緩沖液來進(jìn)行溶液的配制。

2.1.3 顯色時(shí)間的影響由于化學(xué)反應(yīng)進(jìn)度與時(shí)間相關(guān)，且在反應(yīng)過程中紙芯片上溶液的不斷蒸發(fā)也會(huì)對(duì)顯色強(qiáng)度產(chǎn)生一定影響，故需考察顯色時(shí)間對(duì)分析結(jié)果的影響。固定其他實(shí)驗(yàn)條件，每隔1 min拍照，考察顯色時(shí)間(1～10 min)對(duì)結(jié)果的影響(圖4)。由圖可見，檢測(cè)區(qū)的顯色強(qiáng)度在3～6 min時(shí)間內(nèi)比較穩(wěn)定，并在4 min時(shí)最大，之后隨著顯色時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小。因此，最終確定較優(yōu)顯色時(shí)間為4 min。

圖4 顯色時(shí)間對(duì)顯色強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of coloration time on color intensity

圖5 半胱氨酸檢測(cè)的選擇性Fig.5 Selectivity of L-Cys detection

2.2 選擇性考察

本實(shí)驗(yàn)采用L-色氨酸(L-Trp)、L-組氨酸(L-His)、L-丙氨酸(L-Ala)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、DL-谷氨酸(DL-Glu) 5種氨基酸對(duì)該方法的選擇性進(jìn)行考察(圖5)，結(jié)果顯示，在相同條件下，L-Cys的顯色強(qiáng)度遠(yuǎn)高于其他氨基酸，表明該檢測(cè)體系具有良好的選擇性。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

2.4 L-Cys標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在最優(yōu)條件下，制備L-Cys工作曲線并計(jì)算檢出限。結(jié)果表明，在0.01～0.1 mmol/L范圍內(nèi)，顯色強(qiáng)度(y)與L-Cys濃度(x)之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=297.944 2x+106.607，r=0.999 8，計(jì)算得檢出限(高于空白對(duì)照RGB值10)為0.001 mmol/L。

2.5 加標(biāo)回收率及重復(fù)性考察

為了考察方法可靠性，取供試品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(表1)，得方法的加標(biāo)回收率為98.1%～102%。取0.14 mmol/LL-Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=5)為0.6%，日間RSD(n=5)為1.2%，表明本方法重復(fù)性好。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Plus sample recovery test

2.6 與UV結(jié)果的比較

取空白牛血清0.1 mL置于離心管中，加入0.2 mL乙腈，振搖，于10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上層清液，N2吹干，再用純凈水稀釋至1 mL即得血清樣品溶液。將該血清樣品溶液分別采用UV方法(實(shí)驗(yàn)條件見“1.2.3”，借鑒了Ellman方法)和本研究建立的紙芯片法測(cè)定其中的L-Cys。結(jié)果顯示，UV法未檢出，而紙芯片法檢出濃度為0.013 mmol/L。再向血清樣品中加入不同量的L-Cys標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得其加標(biāo)回收率為99.1%～103%(表2)。結(jié)果顯示，紙芯片方法與傳統(tǒng)UV法偏差較小(-0.4%～-0.9%)，結(jié)果可靠，表明本研究建立的紙芯片法可應(yīng)用于實(shí)際血清樣品的檢測(cè)。

表2 血清樣本中L-Cys的測(cè)定Table 2 Detection of L-Cys in serum samples

3 結(jié) 論

本研究以Whatman 1號(hào)定性濾紙作為紙芯片制作材料，選用DTNB作為顯色劑，成功構(gòu)建了一種基于紙芯片快速檢測(cè)L-Cys的新方法。通過手機(jī)拍照采用Photoshop軟件分析顯色強(qiáng)度，從而進(jìn)行比色檢測(cè)。該方法具有較好的選擇性、重復(fù)性和抗干擾能力，采用手機(jī)記錄結(jié)果，便于數(shù)據(jù)傳輸，可及時(shí)將結(jié)果傳遞給分析人員，有望用于實(shí)際生物樣品中含巰基化合物的實(shí)時(shí)診斷。