■林 雪 段靜娜 趙玉蓉 王紅權(quán)*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.廣州天科生物科技有限公司，廣東廣州 510896）

集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中的魚類面對各種各樣環(huán)境應(yīng)激，如高密度養(yǎng)殖條件下的密度脅迫，會引起氧化應(yīng)激[1-2]；魚類對水溫變化有較強(qiáng)的敏感性，溫度應(yīng)激會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生代謝應(yīng)激反應(yīng)[3]；另外，復(fù)雜的水環(huán)境，如水生態(tài)環(huán)境惡化，人工捕撈，水體交換差，水中低氧脅迫[4]，金屬離子過多[5]等等，都會造成一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]；氧化應(yīng)激是動物機(jī)體自由基生成增加或清除能力降低，導(dǎo)致動物機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)功能紊亂，最終引起氧化損傷，代謝酶活性降低，生長受阻[7]。復(fù)合酸化劑避免單一酸化劑功能的單一、腐蝕性強(qiáng)、添加量大等缺點，現(xiàn)多取代單一酸化劑應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)中，可提高動物抗應(yīng)激能力[8-9]。復(fù)合型酸化劑主要是由多種有機(jī)酸復(fù)配而成，各種酸之間起協(xié)同增效的作用，可提高飼料的適口性及飼料轉(zhuǎn)化率，也可作為防霉劑和抗氧化劑保持飼料品質(zhì)，同時還可作為代謝調(diào)節(jié)劑直接被機(jī)體吸收，參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝[10]。有研究表明添加酸化劑對水產(chǎn)動物有一定促進(jìn)生長性能的作用[11-12]。本試驗以羅非魚幼魚為研究對象，研究市場上不同配方組成復(fù)合型水產(chǎn)酸化劑對魚類的生長性能、血清和肝臟抗氧化、酶活性效果的影響，為復(fù)合型酸化劑在水產(chǎn)飼料上的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚的羅非魚由廣州番禺魚種場提供。

酸化劑1（主要成分為甲酸、乙酸和丁二酸），酸化劑2（主要成分為檸檬酸和富馬酸），酸化劑3（主要成分為富馬酸和丙酸）。

試驗的羅非魚基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。以基礎(chǔ)日糧(pH值5.36，系酸力52.98 mmol/100 g)為對照組，分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%酸化劑，配制試驗1 組日糧（pH 值5.31，系酸力50.97 mmol/100 g）、試驗2 組日糧（pH 值5.23，系酸力52.81 mmol/100 g）和試驗3組日糧（pH值5.28，系酸力51.83 mmol/100 g）。所有飼料原料先按配方表1稱料，先混小料，大原料粉碎后40目過篩，將所有原料在攪拌機(jī)中混勻后，邊攪拌邊慢慢加油，最后用雙螺旋擠壓成粒徑約為1.5 mm的條狀飼料，自然風(fēng)干后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(%)

1.2 試驗設(shè)計

試驗用羅非魚魚種運回實驗室后在室內(nèi)循環(huán)過濾水族桶中馴養(yǎng)（容積為500 L）兩周，待其適應(yīng)環(huán)境后，選取體格相近的健康羅非魚300 尾[初始體重為（67.40±0.93）g]，隨機(jī)分成4個處理組，分別為對照組（飼喂基礎(chǔ)飼糧）、試驗1 組（飼喂添加酸化劑1 的日糧）、試驗2組（飼喂添加酸化劑2的日糧）和試驗3組（飼喂添加酸化劑3的日糧），每個處理設(shè)3個重復(fù)桶，每個重復(fù)桶放養(yǎng)25 尾魚。試驗水經(jīng)生化棉過濾，用低壓鼓風(fēng)機(jī)加氧。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間，每天分別在8:00 和16:00 投喂相應(yīng)飼糧，日投食量為魚體重的6%左右，投喂1 h 后吸出殘餌和糞便，然后換水（約1/3 體積）。每天觀察魚的健康狀況，記錄死亡情況，飼養(yǎng)周期共35 d。試驗期間水溫26～30 ℃，pH 值7.0～7.5，NH4+＜0.02 mg/l，亞硝酸鹽＜0.1 mg/l，溶氧＞5 mg/l。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測定

養(yǎng)殖試驗于第36 d結(jié)束，禁食24 h后于第37 d取樣，以桶為單位稱重、記數(shù)，計算生長指標(biāo)。然后每桶隨機(jī)取6尾魚，尾靜脈取血，離心后取血清置于-20 ℃冰箱保存；冰盤上打開腹腔，取出肝臟用濾紙輕輕吸去水分，迅速稱重后儲存在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎媚暇┙ǔ缮锕こ萄芯克噭┖邪凑f明書檢測血清和肝臟樣中的抗氧化和代謝酶活性指標(biāo)。其檢測指標(biāo)為：總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGDH)和異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）。計算增重率、餌料系數(shù)和肝體比指標(biāo)。

增重率(%)=100×(魚末均重-魚初均重)/魚初均重

餌料系數(shù)=魚均餌料攝入量/(魚末均重-魚初均重)

肝體比（%）=100×肝臟重/魚體重

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。單因素方差分析（one-way ANO-VA）比較各組間差異，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同組成酸化劑對羅非魚生長性能和肝體比的影響（見表2）

表2 不同組成酸化劑對羅非魚生長性能的影響

由表2可知，不同組成酸化劑的添加影響羅非魚的末均重、增重率和餌料系數(shù)。試驗1 組（甲酸+乙酸+丁二酸）末均重顯著高于對照組和酸化劑試驗3組（富馬酸+丙酸）（P＜0.05）；而酸化劑試驗2組（檸檬酸+富馬酸）增重率，顯著高于酸化劑試驗3 組（P＜0.05）。

與試驗3 組相比，試驗1 組和試驗2 組餌料系數(shù)顯著降低（P＜0.05），但兩組之間差異不顯著（P＞0.05）

與對照組相比，酸化劑試驗1 組的肝體比降低4.00%，酸化劑試驗2組的肝體比提高11.11%，而酸化劑試驗3 組的肝體比提高了2.22%，但各組間的肝體比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同組成酸化劑對血清和肝臟生化指標(biāo)的影響(見表3、表4)

表3 不同組成酸化劑對羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組、酸化劑試驗1組和試驗3組相比，酸化劑試驗2組顯著提高血清的總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）（P＜0.05）；但是酸化劑的添加并未顯著改變血清總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）。

表4 不同組成酸化劑對羅非魚肝臟生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗1組和試驗3組顯著降低肝臟T-AOC；但是，不同組成的復(fù)合酸化劑對肝臟T-SOD、MDA、ACP、AKP、異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGDH）并未有顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

在飼料中加入酸化劑，可使其胃腸道pH值下降，保證消化酶在正常pH 值環(huán)境下發(fā)揮酶活性，從而提高飼料中蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素的消化率[8]，并且有一定的誘食和促生長效果[9，13]。而復(fù)配酸化劑總酸含量高，各成分間協(xié)同增效作用強(qiáng)，降低胃腸道pH 值，起到抑菌殺菌作用，并且其中某些有機(jī)酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，可直接參與機(jī)體中的物質(zhì)代謝，可被直接吸收利用。尚衛(wèi)敏等[11]發(fā)現(xiàn)添加乳酸、檸檬酸和復(fù)合酸顯著改善草魚增重率與飼料轉(zhuǎn)化率；潘慶等[14]也發(fā)現(xiàn)在飼料中分別添加0.3%檸檬酸、乳酸也能提高羅非魚幼魚的生長性能，但0.3%富馬酸反而降低羅非魚對飼料的利用。本研究中，不同配伍酸化劑對羅非魚生長性能的影響存在差異，甲酸+乙酸+丁二酸和富馬酸+檸檬酸的復(fù)合酸化劑配伍與對照組相比都促進(jìn)羅非魚的生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率，而富馬酸+丙酸的配伍則并未發(fā)現(xiàn)該效果，一是由于酸降低了飼料的pH 值，二是由于酸的抑菌抗菌作用。而酸類酸化日糧的能力強(qiáng)弱甲酸＞蘋果酸=檸檬酸＞乙酸。并且每種酸都有其獨特的pK 值，定義為酸50%解離時的pH值。pK值越大，酸解離越難。甲酸pK值為3.77，殺菌抑菌效果非常明顯。任何一種酸調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)都需要在一定的pH 值范圍內(nèi)進(jìn)行，由幾種可在不同pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用的有機(jī)酸復(fù)配在一起拓寬了抑菌和調(diào)菌區(qū)系，使得添加量更少，作用效果更顯著，各組分能相互起到協(xié)同增效的作用。因此飼料中添加甲酸+乙酸+丁二酸的復(fù)合酸不僅可以有效的酸化日糧，保證消化酶在正常pH值環(huán)境下發(fā)揮酶活性，促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以優(yōu)化羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，減弱有害微生物對宿主的影響。試驗2組中添加的檸檬酸是羅非魚體內(nèi)三羧酸循環(huán)中由乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合而成的第一個中間產(chǎn)物，是機(jī)體容易利用的能源，可被直接吸收參與體內(nèi)能量、酸堿平衡等一系列重要代謝過程，從而提高羅非魚對日糧中養(yǎng)分物質(zhì)的消化吸收。

動物機(jī)體的總抗氧化能力T-AOC與機(jī)體的健康程度存在密切關(guān)系，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)包含有酶促與非酶促兩個體系，其中T-SOD 屬于酶促體系[6，15-16]。在本試驗中，各組間血清和肝臟的T-SOD 活性都沒有顯著性差異，但是，酸化劑試驗2 組中的血清TAOC 顯著上升，而T-AOC 作為評價機(jī)體抗氧化性能的總體指標(biāo)，其大小可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，其提高表明改善了魚的抗氧化系統(tǒng)功能，提高了魚機(jī)體的抗氧化性能[17-18]，這說明作為高效抗氧化劑的檸檬酸在富馬酸的協(xié)同作用下更好地清除魚體內(nèi)過多活性氧自由基分子，有效清除超氧陰離子（O2-·）抑制和切斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[19]。更好地維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡[20]，檸檬酸形成能量的途徑比葡萄糖還短，在應(yīng)激狀態(tài)下可用于ATP 的緊急合成，提高機(jī)體的非特異性抵抗力，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力。而富馬酸的添加則具有協(xié)同作用，可以有效增強(qiáng)檸檬酸的抗氧化作用[21]。

ACP與AKP是機(jī)體兩種重要的功能調(diào)節(jié)酶，與機(jī)體的生長密切相關(guān)[22]。其血清ACP 和AKP 活力受攝食狀況、生長階段、環(huán)境等因素影響而發(fā)生變化[3]。ACP 是在酸性條件下催化磷酸單酯的水解酶[23-24]，AKP 廣泛存在于各種動物體內(nèi)，能催化水解磷酸單酯，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，是動物體內(nèi)重要的解毒體系[11]；AKP 也是一種腸上皮刷狀緣膜酶，與魚類的消化間接相關(guān)[25-26]，一般認(rèn)為，魚體內(nèi)AKP 參與了魚腸上皮細(xì)胞的吸收與轉(zhuǎn)運，協(xié)助腸上皮細(xì)胞吸收葡萄糖、脂類、鈣和無機(jī)磷[27]。本試驗結(jié)果顯示，不同配伍的酸化劑對羅非魚血清ACP 和AKP 的影響差異顯著，檸檬酸+富馬酸組的血清ACP 和AKP 與富馬酸+丙酸組相比顯著提高，這與之前試驗結(jié)果一致。有研究表明，水生動物中添加檸檬酸可以有效的提高干物質(zhì)消化率，促進(jìn)消化酶發(fā)育。在奧尼羅非魚飼料中添加10 g/kg檸檬酸使胃蛋白酶活性提高29.6%，肝胰臟和腸道淀粉酶活性分別提高30.7%和29.4%（P＜0.01）。而檸檬酸可以改善酶活性可能與其降低胃腸道pH 值并作為中間物質(zhì)直接參與能量代謝有關(guān)，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

單一酸化劑具有功能單一、添加量大、刺激性強(qiáng)等缺點，而復(fù)合酸化劑可以有效克服上述缺點。進(jìn)行復(fù)合酸化劑配伍時，除應(yīng)根據(jù)日糧系酸力來確定滿足維持機(jī)體消化道酸度所需的酸化劑添加量、實現(xiàn)日糧酸化與電解質(zhì)平衡[28-29]，還應(yīng)根據(jù)不同酸的解離度以及作用機(jī)理進(jìn)行合理配比，從而充分發(fā)揮酸化劑生理功能[30]。本試驗結(jié)論表明，甲酸+乙酸+丁二酸以及檸檬酸+富馬酸的復(fù)合酸化劑配伍實現(xiàn)了不同酸化劑之間的協(xié)同合作，有效改善羅非魚生長性能，提高機(jī)體抗氧化能力。