■金曉峰 焦仁剛 趙 貴 黃 鑫 欒慶祥 章厲劼 孫播東

（貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州貴陽 550003）

近年來，隨著乳制品工業(yè)的發(fā)展以及我國養(yǎng)殖水平的提高，乳清粉已經(jīng)成為幼畜尤其是乳豬飼料中不可缺少的原料之一[1]，具有提高幼齡仔豬的采食量和生長速度[2]、降低仔豬血清尿素氮，增強蛋白質(zhì)沉積能力[3]、調(diào)節(jié)免疫力[4]等作用，廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)。

喹烯酮(Quinocetone)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制的畜禽抗菌、止瀉、促生長新藥，屬喹噁啉類藥物，為淡黃色或黃綠色粉末，不溶于水，略溶于部分有機溶劑，對光敏感，較易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)[5]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 喹烯酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式

喹烯酮的毒性小，作為飼料添加劑，具有提高動物生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率，降低腹瀉率和死亡率等功能[6]，被應(yīng)用于藥物飼料添加劑。但2009年有研究顯示，喹烯酮具有潛在的遺傳毒性，能造成遺傳物質(zhì)的損傷[7]。因此，有必要控制喹烯酮的使用，并建立飼料及飼料原料中喹烯酮含量的方法，以監(jiān)控飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全情況。

目前，我國已建立了飼料中喹烯酮的檢測方法[8]，但通過試驗驗證，不適用于乳清粉等高蛋白含量的飼料原料，無法檢出其中喹烯酮含量。其他已報道的喹烯酮含量測定方法還有液相色譜法[9-11]，經(jīng)試驗驗證，也無法檢出乳清粉等高蛋白含量的飼料原料中喹烯酮含量。鑒于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)擁有更高的靈敏度和更好的準(zhǔn)確性，本文研究并建立了一種采用液質(zhì)聯(lián)用法測定飼料原料乳清粉中喹烯酮含量的方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器

Waters XEVO TQ-xs 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國沃特世公司）；Milli-Q Direct-Q10 超純水機（美國密理博公司）；SIGMA 3K15 高速冷凍離心機（德國西格瑪公司）；METTIJER AB104-S電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Reacti-Therm Ⅲ氮吹儀（美國賽默飛公司）；IKA MINISHARKER 渦旋振蕩器（德國伊卡公司）；SG5200HPT超聲波清洗機（上海冠特儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

喹烯酮對照品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；Waters PRiME HLB 固相萃取柱（規(guī)格為60 mg/3 ml，美國沃特世公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，德國默克公司）；二甲亞砜（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；試驗用水均為Milli-Q Direct-Q10超純水。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量喹烯酮對照品于棕色容量瓶中，少量二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋得到含喹烯酮濃度為1 000 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取適量喹烯酮儲備液，用甲醇稀釋得到含喹烯酮10 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)中間液。為消除基質(zhì)效應(yīng)，本方法采用基質(zhì)加標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別精密量取適量的喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)中間液，加入到凈化后的空白試樣中，50 ℃下氮氣吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，繪制濃度為20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.2 飼料原料乳清粉中喹烯酮的提取

稱取飼料原料乳清粉(1.00±0.05) g 于50 ml 離心管中，加入80%乙腈（含甲酸0.2%）10 ml，渦旋提取1 min，超聲提取15 min，于10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上層提取液于另一離心管中，備用。

2.3 飼料原料乳清粉中喹烯酮的凈化

將PRiME HLB 固相萃取柱安裝到真空萃取裝置上，取1 ml上清液過柱，收集全部濾液，備用。

2.4 測定方法

將前處理后的樣品液于50 ℃下氮氣流吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，過0.22 μm 濾膜后供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

已有的報道中測定方法多為液相法或液質(zhì)法，液相法多采用高效系統(tǒng)，質(zhì)譜系統(tǒng)多采用電噴霧離子源（+）的方式，本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn)[8，12]，對液質(zhì)聯(lián)用儀的儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.4.1 色譜條件

色譜柱（型號為Waters BEH Shield RP18 ，規(guī)格為1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為1 μl，流速為0.3 ml/min，流動相采用甲醇+0.2%甲酸水溶液（梯度方式），梯度比例見表1。

表1 高效液相色譜流動相梯度條件

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧ESI+，源溫為120 ℃，霧化溫度為400 ℃，霧化氣流流速為500 L/h，錐孔氣流流速為60 L/h。

2.4.3 喹烯酮特征離子（見表2）

表2 喹烯酮特征離子

3 結(jié)果

3.1 試驗譜圖

經(jīng)上述方法測試，標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣及陽性添加試樣經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析得到的圖譜見圖2～圖4。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子圖譜

圖3 空白試樣特征離子圖譜

喹烯酮對照品工作液按峰面積以外標(biāo)法進(jìn)行回歸計算，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，在線性范圍為20～1 000 ng/ml下相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1。

3.3 提取劑的選擇

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道中，喹烯酮通常使用40%乙腈[8]、100%乙腈[9]、60%乙腈[10]、甲醇-乙腈溶液（1∶1）[12]、0.5%磷酸緩沖液(pH=3.0)[13]等作為提取劑。飼料原料乳清粉蛋白質(zhì)含量極高，經(jīng)試驗驗證以上提取劑的提取效果均不理想，本研究比較了上述提取劑和甲酸酸化的80%乙腈的效果（結(jié)果見表3），最終選擇甲酸酸化的80%乙腈為本方法提取液。

3.4 凈化方式的選擇(見表4)

圖4 陽性添加樣品特征離子圖譜

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道中，喹烯酮凈化方式主要有HLB 固相萃取[8，11]、中性氧化鋁固相萃取[12]，也有不經(jīng)過凈化，直接上機測定含量的方式[9，13]。省去凈化環(huán)節(jié)可減少前處理操作，但樣品基質(zhì)較復(fù)雜，不利于儀器的長期使用，同時帶來的基質(zhì)效應(yīng)也非常強，本研究選擇了新一代PRiME HLB 固相萃取柱，樣品提取液不經(jīng)過淋洗和洗脫過程，減少前處理操作的同時，也起到了良好的凈化作用。

3.5 靈敏度考察

向空白試樣中添加適量喹烯酮，經(jīng)上述方法測試液質(zhì)聯(lián)用試驗譜圖，觀察特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比（S/N）和對應(yīng)藥物的濃度，S/N＞3 者為方法檢測限，S/N＞10 者為方法定量限。當(dāng)樣品中喹烯酮含量為5 μg/kg 時，液質(zhì)譜圖中喹烯酮峰S/N＞3，即檢測限為10 μg/kg；當(dāng)樣品喹烯酮含量為10 μg/kg時，液質(zhì)譜圖中S/N＞10，即定量限為10 μg/kg。說明當(dāng)飼料原料乳清粉中喹烯酮含量高于0.5 μg/kg時即可檢出，當(dāng)含量高于1.0 μg/kg時即可準(zhǔn)確定量。

圖5 喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.6 準(zhǔn)確度和精密度考察

表3 提取劑回收試驗結(jié)果

表4 不同凈化方式回收試驗結(jié)果

向空白試樣中添加適量喹烯酮，制備得到喹烯酮含量分別為20、50、100、500 μg/kg 的陽性添加試樣，每個濃度6 份平行試樣，按上述最佳方法進(jìn)行提取、凈化、濃縮、測定，以實測含量與理論含量的百分比計算回收率，考察方法的準(zhǔn)確度；同時計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以批內(nèi)和批間試驗結(jié)果的RSD考察方法的精密度。試驗結(jié)果如表5。

由表5 可知，飼料原料乳清粉中各濃度喹烯酮含量測定回收率范圍在79.9%～90.8%之間，準(zhǔn)確度較高。

表5 飼料原料乳清粉樣品準(zhǔn)確度及精密度試驗結(jié)果（n=6）

從飼料原料乳清粉中各濃度喹烯酮含量測定結(jié)果分析試驗精密度，批內(nèi)變異系數(shù)RSD 為1.71%～4.48%，批間變異系數(shù)RSD為5.24%，精密度較高。

4 討論

4.1 提取劑的選擇

本文研究了甲酸酸化的80%乙腈、40%乙腈、60%乙腈、甲醇-乙腈溶液（1∶1）、0.5%磷酸緩沖液、100%乙腈等提取劑的提取效果。磷酸緩沖液應(yīng)不具備揮發(fā)性，不適用于液質(zhì)聯(lián)用法檢測，未進(jìn)行測試，40%乙腈、60%乙腈加入到飼料原料乳清粉中，因樣品溶解到提取液中，改變了極性，形成明顯的分層現(xiàn)象，經(jīng)試驗測試，上下兩層均有喹烯酮，但濃度比例沒有規(guī)律，未采用該兩種提取液；其余三種提取液經(jīng)試驗比較，甲酸酸化的80%乙腈提取效率較好，最終確定為提取劑。

4.2 選擇凈化方式

比較了HLB固相萃取和PRiME HLB固相萃取柱的凈化效果，均達(dá)到預(yù)期要求，因PRiME HLB方法簡化了前處理過程，凈化時間由40 min縮短至5 min，故本文選擇了PRiME HLB 的凈化方式，取得的效果較為滿意。

4.3 避光操作

喹烯酮是喹噁啉類藥物，見光易分解的，試驗過程應(yīng)注意避光操作，對照溶液應(yīng)存放在棕色溶劑瓶中，試樣上機液也應(yīng)盛放于棕色樣品瓶中。

5 結(jié)論

本文研究了飼料原料乳清粉中喹烯酮藥物提取方法、凈化方法對試驗結(jié)果的影響，建立了采用甲酸酸化的80%乙腈提取飼料原料乳清粉中的喹烯酮，PRiME HLB 固相萃取凈化，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定喹烯酮的含量的方法。經(jīng)試驗，確定了方法的線性范圍、靈敏度，同時驗證了試驗方法的準(zhǔn)確度、精密度，填補了飼料原料乳清粉中喹烯酮含量檢測的技術(shù)空白。