川牛膝、麻牛膝及雜交牛膝多糖的分離、純化和對豬小腸上皮細胞活性的比較研究

■趙 磊 馮 鑫 陳 容 李麗霞*

（1.四川省食品藥品學校，四川峨眉 614201；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 天然藥物研究中心，四川成都 611130）

川牛膝為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuna）的干燥根。主產(chǎn)于四川雅安天全、金口河一帶，為川產(chǎn)道地藥材。具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的作用，經(jīng)常用于經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、風濕痹痛、跌撲損傷、足痿筋攣、尿血血淋等疾病[1]。但在產(chǎn)區(qū)，還廣泛分布有麻牛膝和雜交牛膝，因形態(tài)和親緣關(guān)系與川牛膝非常相近，故?；烊氪ㄅＯト胨?。

麻牛膝為莧科植物頭花杯莧(Cyathula capitata Moq)的根。雜交牛膝來源于C.officinalis×C.capitata，為川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)與頭花杯莧(Cyath-ula capitata Moq)的自然雜交種[2]。目前對于川牛膝研究報道較多，但對川牛膝及其混偽品的比較研究還較少，有學者對其從性狀鑒別和化學成分等方面對三種牛膝進行鑒別。多糖為川牛膝的主要活性部分，具有抗腫瘤[3-4]、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老[5-6]、提高機體免疫力[7-8]和提高紅細胞免疫功能[9]等藥理活性。目前對于三種牛膝多糖組分和活性的比較研究還是空白，多糖含量和組分的差異，是反映三種牛膝品質(zhì)和臨床療效差異的重要指標。

全球各國養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，飼料的安全備受關(guān)注的問題，特別是使用飼料添加劑存在的問題尤其明顯[10]?，F(xiàn)如今酶制劑、中草藥、寡糖、益生素、酸化劑等添加劑正在逐步取代抗生素作為新的飼料添加劑[11]。已有研究表明在飼料中加入中藥或其活性成分作為飼料添加劑，具有促進動物生長[12-13]、改善動物生產(chǎn)性能[14-15]、提高免疫力[16]、增強繁殖機能[17-18]、防病抗病的功能[19]。

本文分別提取了3種牛膝的粗多糖，并采用陰離子交換柱和凝膠柱對其進行分離、純化，比較了3中牛膝粗多糖含量、組分差異和分子量差異，測定了3種多糖對豬小腸上皮細胞的細胞活性和炎癥細胞因子IL-6基因的表達情況的影響。擬為川牛膝及其混偽品的品質(zhì)評價提供依據(jù)，為開發(fā)一種天然的飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

川牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）；麻牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為頭花杯莧(Cyathula capi-tata Moq)；雜交牛膝采自四川省雅安市天全縣，經(jīng)鑒定為雜交牛膝（C.officinalis×C.capitata）。

1.2 主要試劑

95%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、碳酸氫鈉溶液、1 mmol/l EDTA、0.1%疊氮化鈉溶液、DEAE-瓊脂糖凝膠FF（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）、瓊脂糖凝膠6FF（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500 和Dextran T-2 000（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）、氯化鈉、苯酚、硫酸，以上試劑均為分析純，CCK-8 試劑盒（CA1210，北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

電熱鼓風干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、離心機、中壓層析柱（50 mm×40 cm，上海精科實業(yè)有限公司）、凝膠層析柱（25 mm×100 cm，上海精科實業(yè)有限公司）、電腦自動部分收集器（BSZ-160F，上海精科實業(yè)有限公司）、酶標儀（Varioskan flash，Thermo Fisher Scientific）、電子天平（JA2003B，上海越平科學儀器有限公司）、冷凍干燥機（LyoQuest-5，賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 粗多糖的提取

取藥材粉末200 g，用95%乙醇、50%乙醇除雜。殘渣再加入蒸餾水提取2 次，濾液濃縮至近干，冷凍干燥，得粗多糖。精密稱重，計算得率。

1.5 洗脫曲線的制備

利用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[20]。按多糖洗脫液200 μl，苯酚200 μl，硫酸1 ml的反應(yīng)體系，振搖使其充分反應(yīng)，冷卻至室溫后，移取100 μl至96孔板，再用酶標儀在波長490 nm處測定其吸光度，以吸光度A值為縱坐標，洗脫液體積為橫坐標，制作洗脫曲線。

1.6 陰離子交換分離純化

精密稱取粗多糖0.5 g，用50 ml 蒸餾水溶解，用透析袋（分子量為3 500 Da）透析后，3 000 r/min離心后，取上清0.45 μm濾膜過濾。樣品上DEAE-瓊脂糖凝膠FF 柱，用蒸餾水洗脫，流速1 ml/min，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得中性多糖。再用0～1.5 mol/ml的氯化鈉溶液進行梯度洗脫，收集洗脫液，10 ml/管，苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，制作洗脫曲線后，收集不同洗脫峰的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得酸性多糖和中性多糖。精密稱重，計算得率。

1.7 凝膠柱層析分離純化

將分子量分別為10 000、40 000、70 000、500 000、2 000 000 的多糖標準品和蒸餾水溶解后的中性和酸性多糖樣品上瓊脂糖凝膠6FF 柱，蒸餾水洗脫，用苯酚-硫酸比色法[10]測定每一管標準品洗脫液的吸光值，取5 個標準品分子量的對數(shù)為橫坐標，以5 個含量曲線峰值對應(yīng)的體積為縱坐標，制作標準曲線，并進行線性關(guān)系分析，得到線性方程。取酸性及中性多糖樣品20 mg 溶于5 ml 蒸餾水中，上瓊脂糖凝膠6FF 柱，收集洗脫液，10 ml/管，苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，制作洗脫曲線。根據(jù)樣品的洗脫曲線不同洗脫峰峰值所對應(yīng)的體積，帶入線性方程，得到不同洗脫峰對應(yīng)的分子量。根據(jù)分子量的不同，合并樣品洗脫液，濃縮至近干，冷凍干燥，計算得率。

1.8 細胞培養(yǎng)

將IPEC-J2 細胞接種在含10% FBS（Gibco）的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待合適密度時，將細胞接種到6孔板中（每孔含1×106個細胞）；加入多糖處理12 h后，收集細胞進行基因表達檢測。此外，還將細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板中（每孔5×104個細胞），多糖（5 mmol/l和10 mmol/l）處理12 h后使用CCK-8試劑盒測定細胞活性。

1.9 細胞活性分析

細胞活性使用CCK-8 試劑盒，通過試劑盒說明書中的方法測定。即在培養(yǎng)板中加入CCK-8溶液（每孔中每100 μl加入10 μl），然后將培養(yǎng)板在37 ℃孵育1 h。使用酶標儀測定每孔在450 nm處的吸光度值。

1.10 熒光定量PCR

將多糖處理完的細胞吸取培養(yǎng)基后，利用Trizol萃取法提取細胞總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermmentas）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以GAPDH（Fr 5’-TGGAAGGACTCATGACCACA-3’；5’-AGGGGTCTA-CATGGCAACTG-3’）為內(nèi)參，利用熒光定量PCR檢測IL-6（Fr 5’-GGAAATCGTGGAAATGAG-3’；Rv 5’-GCTTAGGCATAACGCACT-3’）的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 三種牛膝的粗多糖含量比較(見表1)

由表1可知，3種牛膝粗多糖含量差異很大，其中川牛膝的粗多糖含量最高，得率最高；其次是麻牛膝，最后是雜交牛膝，得率僅為0.38%。

表1 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝粗多糖含量比較

2.2 三種牛膝多糖組成的比較研究(見表2)

表2 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖組成比較

由表2 可知，3 種牛膝多糖構(gòu)成差異較大，其中川牛膝多糖主要為酸性多糖，麻牛膝和雜交牛膝中性多糖和酸性多糖所占比例基本相當。3 種牛膝中中性多糖含量最高的是麻牛膝，最低的是川牛膝，麻牛膝中性多糖含量比川牛膝高約21 倍，酸性多糖含量最高的為川牛膝，最低的為雜交牛膝，川牛膝酸性多糖含量為雜交牛膝的8.4倍。

2.3 3種牛膝多糖分子量分布比較

2.3.1 標準曲線的制備結(jié)果

以標準品分子量的對數(shù)為橫坐標（x），以5 個含量曲線峰值對應(yīng)的體積為縱坐標（y），得到線性方程為y=-102.18x+771.11，R2=0.994 7。

2.3.2 3種牛膝中性多糖的分子量分布比較

川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖分子量比較數(shù)據(jù)見表3。麻牛膝中性多糖純化圖譜見圖1，麻牛膝酸性多糖分離純化圖譜見圖2。

表3 川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝多糖分子量比較

圖1 麻牛膝中性多糖純化圖譜

由表3可知，川牛膝酸性多糖相對分子量分布比較廣，其中分子量在10 000 Da 以下的占酸性多糖的34.13%，10 000～30 000 Da 的占酸性多糖的4.44%，200 000～400 000 Da占酸性多糖的29.69%，1 200 000～1 700 000 Da的占粗多糖的31.74%。麻牛膝中性多糖分子量主要集中在7 500 Da左右，在中性多糖中占比達99.64%；酸性多糖分子量主要是分布在680 000 Da左右，占酸性多糖的80.99%。從雜交牛膝中純化得到一種中性多糖，其分子量主要集中在6 000 Da 左右；雜交牛膝酸性多糖分子量分布范圍較廣，且各分子量所占比例相差不大，分子量在6 500 Da左右的占酸性多糖的22.73%，分子量在157 000 Da 左右的占酸性多糖的27.27%，分子量在1 600 000 Da左右的占粗多糖的20.45%，分子量在2 100 000 Da左右的占酸性多糖的29.55%。

2.4 細胞活力檢測結(jié)果

因雜交牛膝多糖含量較少，無法進行進一步的活性實驗，所以本試驗未進行后續(xù)的多糖活性試驗。

0、5 μg/ml和10 μg/ml劑量川牛膝和麻牛膝多糖樣品作用后測定豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）的細胞活力，檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，高劑量和低劑量的川牛膝多糖及麻牛膝多糖均對細胞活力無明顯影響。

2.5 IL-6表達結(jié)果

10 mmol/l 藥物作用后進行豬小腸上皮細胞IL-6基因表達檢測，IL-6表達結(jié)果見圖4。由圖4可知，川牛膝多糖和麻牛膝多糖都可使IL-6 的表達顯著降低，且川牛膝多糖效果優(yōu)于麻牛膝多糖。

圖2 麻牛膝酸性多糖分離純化圖譜

圖3 細胞活性檢測結(jié)果

圖4 炎癥細胞因子IL-6表達結(jié)果

3 討論

3.1 3種牛膝多糖的組分比較

川牛膝藥材品種混亂，目前市售川牛膝藥材中多夾雜麻牛膝和雜交牛膝。在有的地區(qū)，出現(xiàn)以麻牛膝和雜交牛膝代替川牛膝使用的現(xiàn)象[2]。目前對于川牛膝及其混淆品的研究主要集中在原植物鑒別、原藥材性狀鑒別和杯腺甾酮含量差異上[21-22]，未見關(guān)于川牛膝及其混淆品粗多糖含量及多糖組成差異比較的報道。本研究對此進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)3種牛膝粗多糖含量差異較大。其中川牛膝粗多糖含量最高，為7.40%，雜交牛膝粗多糖含量最低，為0.38%，川牛膝粗多糖含量為麻牛膝粗多糖的4.4 倍，雜交牛膝的19.5倍。且川牛膝的多糖以酸性多糖為主，占總多糖的94.40%，麻牛膝和雜交牛膝的中性多糖和酸性多糖所占比例差異不大。3 種牛膝多糖分子量差異較大，其中川牛膝多糖分子量主要集中在7 500 Da 左右，麻牛膝的中性多糖分子量主要集中在7 500 Da，酸性多糖分子量主要集中在680 000 Da 左右，雜交牛膝的中性多糖分子量主要集中在6 000 Da，酸性多糖分子量主要集中在2 100 000 Da左右。

多糖為川牛膝的主要活性成分，具有抗氧化[23]、抗衰老[24]、提高免疫力[25]、抗腫瘤[26]的作用。因此以多糖作為評價川牛膝品質(zhì)的重要指標是很有意義的。本研究結(jié)果表明以多糖為指標評價川牛膝及其混淆品的品質(zhì)，則川牛膝質(zhì)量最好，而麻牛膝和雜交牛膝由于多糖含量和組成差異很大，故不能替代川牛膝入藥。

3.2 3種牛膝多糖對豬小腸上皮細胞活性的影響

在與多糖相關(guān)的藥理活性中，3 種牛膝的療效差異尚未見報道，本研究在獲得川牛膝及其混淆品的粗多糖和純化多糖的基礎(chǔ)上，進一步測定了三種牛膝多糖對細胞活性及炎癥細胞因子IL-6相關(guān)基因表達量的影響。結(jié)果表明川牛膝和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細胞活性無顯著影響，炎癥細胞因子IL-6 的相關(guān)表達試驗表明川牛膝多糖和麻牛膝多糖都可使炎癥細胞因子IL-6的表達顯著降低。證明川牛膝多糖和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細胞無毒性、能抑制細胞的炎癥反應(yīng)，且川牛膝多糖炎癥反應(yīng)抑制效果更好。

全世界的飼料總產(chǎn)量在逐年增加，2017年中國的飼料總產(chǎn)量位居世界第一，國內(nèi)抗生素類藥物被廣泛用作飼料添加劑，隨著抗生素殘留問題的日趨顯現(xiàn)，使研究者們意識到必須限制抗生素的濫用[27]。中藥作為代替抗生素的首選目標，其優(yōu)勢在于，中藥來源于大自然中的藥用植物[28-30]、藥用菌物[31]、藥用礦物[32]等廣博資源，以無抗藥性、低殘留、不會對環(huán)境造成污染為優(yōu)勢和特點。本次試驗已經(jīng)證明了川牛膝多糖對豬小腸上皮細胞的活性沒有影響，且能顯著降低炎性基因的表達，這表明川牛膝、麻牛膝和雜交牛膝及其多糖具有成為一種新的飼料添加劑的潛力。

3.3 研究意義

本研究為解決川牛膝目前購銷和臨床應(yīng)用混亂的現(xiàn)象提供了科學依據(jù)，對川牛膝及其混淆品的品質(zhì)評價提供了思路和方法。川牛膝多糖對豬小腸上皮細胞活性無明顯影響，對炎癥反應(yīng)良好的抑制效果，為川牛膝及其多糖作為飼料添加劑的進一步開發(fā)利用提供了新的實驗證據(jù)和方向。

4 結(jié)論

3種牛膝中，川牛膝多糖含量最高，且以酸性多糖為主，麻牛膝和雜交牛膝的中性多糖和酸性多糖所占比例差異不大，3 種牛膝多糖的分子量差異較大。以多糖為指標評價川牛膝及其混淆品的品質(zhì)，則川牛膝質(zhì)量最好。

川牛膝多糖和麻牛膝多糖對豬小腸上皮細胞無毒性、能抑制細胞的炎癥反應(yīng)，且川牛膝多糖炎癥反應(yīng)抑制效果更好。