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      內(nèi)窺鏡引導(dǎo)氣管注入博來霉素建立小鼠肺纖維化模型

      2019-05-17 08:43:52余華軍林碧云歐華俊張海濤
      關(guān)鍵詞:博來霉素內(nèi)窺鏡肺纖維化

      余華軍, 吳 尚, 黃 慧, 林碧云, 伍 俊, 歐華俊, 張海濤

      (廣東醫(yī)科大學(xué)1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 湛江 524023;2. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 湛江 524023;3. 附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湛江 524001)

      特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的病因不明,可由環(huán)境中的有害物質(zhì)、病毒感染、胃食管反流和吸煙等因素刺激,通過炎癥、組織損傷、修復(fù)持續(xù)疊加造成上皮細(xì)胞損傷和成纖維細(xì)胞活化,引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積,最終發(fā)展為肺纖維化。建立穩(wěn)定的肺纖維化動(dòng)物模型,對(duì)抗肺纖維化藥物篩選和評(píng)價(jià)極其重要。目前國(guó)際上應(yīng)用最為廣泛的是博來霉素誘導(dǎo)動(dòng)物肺纖維化模型。該模型主要通過氣管給藥、經(jīng)鼻滴注、腹腔注射或靜脈給藥等方法建立[1-4],其中一次性氣管內(nèi)灌注的方法使用較為普遍。氣管內(nèi)灌注又分為直接灌注和間接灌注,兩者主要是有創(chuàng)與無創(chuàng)的區(qū)別。在肺纖維化小鼠模型制備的動(dòng)物選擇方面,C57BL/6J 小鼠是最常用品系[5]。目前研究及應(yīng)用的小鼠氣管插管給藥方法中,大多借助于專用儀器設(shè)備輔助插管。但普遍存在的不足是小鼠咽部結(jié)構(gòu)視野范圍較小及模糊,不能清晰直觀進(jìn)行插管操作。本研究擬采用在多功能內(nèi)窺鏡直視下對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行氣管插管,并通過此方法建立博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,分析及評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的穩(wěn)定性,為今后氣管給藥、肺纖維化及相關(guān)肺部疾病的研究應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

      1 材料與儀器

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠15 只,18~22 g,雌雄各半,購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2016-0029]。常規(guī)飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)設(shè)施,12/12 h 晝夜光照,溫度 22~24 ℃,相對(duì)濕度 70%[SYXK(粵)2015-0147]。

      1.2 主要試劑和儀器

      博來霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司; 羥脯胺酸(HYP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成公司;生理鹽水、水合氯醛、內(nèi)窺鏡、冷光源放大鏡和恒溫加熱板均購(gòu)自北京鼎國(guó)公司; 病理組織切片機(jī)和石蠟包埋機(jī)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

      1.3 方法

      1.3.1 內(nèi)窺鏡直視下氣管插管操作步驟 ①使用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉5 只小鼠,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5 只; ②用絲線圈住小鼠門牙將小鼠懸掛在木板上,背部用泡沫墊高,保持頭部和水平的角度在45°左右,用鑷子輕輕順向拉出舌頭; ③冷光源放大鏡放于動(dòng)物上部,用咽拭子將咽部分泌物擦凈,使用棉簽下壓舌部調(diào)整動(dòng)物傾斜角度; ④使用已酒精消毒的內(nèi)窺鏡探頭伸入小鼠口腔內(nèi),調(diào)整角度直至可通過內(nèi)窺鏡顯示面板清晰看到聲門,固定探頭軟管; ⑤手持氣管導(dǎo)管貼門牙中間進(jìn)針,沿著上顎中線插入,觀察小鼠呼吸頻率,在小鼠呼吸時(shí),聲門打開的瞬間插入導(dǎo)管,注入50 μL 印度墨汁; ⑥迅速?gòu)臍獾腊纬鎏坠茚?,抓著小鼠耳背皮膚直立旋轉(zhuǎn)30 s,使藥物在肺內(nèi)分布均勻,側(cè)臥位放置于恒溫加熱板(37 ℃)上。

      1.3.2 實(shí)驗(yàn)處理 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5 只,按上述操作步驟,分別氣管給予50 μL的生理鹽水和50 μL平3.5 mg/kg 的博來霉素[6]。

      1.3.3 博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型鑒定 常規(guī)飼養(yǎng)28 d[7],頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠左肺浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液中固定,進(jìn)行石蠟包埋,病理切片,HE、Masson 染色,小鼠右肺進(jìn)行HYP、MDA、GSH-PX、SOD 檢測(cè)。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料用x- ± s表示, 多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析, 兩組間比較采用t 檢驗(yàn), P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 多功能內(nèi)窺鏡直視下氣管插管

      在多功能內(nèi)窺鏡顯示面板上掌握小鼠的呼吸頻率,在聲門打開瞬間迅速插入導(dǎo)管,一邊管口封堵30 s,小鼠此時(shí)出現(xiàn)躁動(dòng)、口唇紫紺等缺氧癥狀,解除封堵后小鼠呼吸恢復(fù)、缺氧癥狀逐漸緩解,則表明插管成功[8]。

      2.2 插管過程

      按照上述的氣管插管方法,使用頸椎脫臼法處死小鼠,解剖暴露氣管及胸腔,發(fā)現(xiàn)5 只注入印度墨汁的小鼠氣管下端直至肺部均有黑色物質(zhì)均勻分布(圖1)。且各組小鼠均插管成功,插管成功率高,給藥量精確,插管后無小鼠死亡情況。

      2.3 博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型

      由表1可見,小鼠肺組織中HYP、MDA含量,與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組含量增加(P<0.01); 小鼠肺組織中GSH-PX、SOD 活性,與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組活性降低(P<0.01)。小鼠肺組織進(jìn)行病理切片經(jīng)HE、Masson 染色, 顯微鏡下觀察(圖2), 對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)清晰, 實(shí)驗(yàn)組肺泡間隔顯著變寬, 肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,萎縮塌陷嚴(yán)重,膠原纖維顯著增多,出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。從以上生化指標(biāo)及病理學(xué)觀察結(jié)果表明,應(yīng)用該氣管插管方法,復(fù)制博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的模型成功率較高。

      3 討論

      在醫(yī)學(xué)研究上, 人們通常借助于人類疾病動(dòng)物模型來認(rèn)識(shí)和研究各種疾病的發(fā)展及防治。建立合適的肺纖維化動(dòng)物模型對(duì)臨床上治療肺纖維化疾病藥物的篩選, 探討其發(fā)病機(jī)制具有重要的作用。誘導(dǎo)肺纖維化常用博來霉素、二氧化硅、異硫氰酸熒光素, 通過輻射、病毒載體和轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)等[9,10]。應(yīng)用博來霉素來誘導(dǎo)肺纖維化是目前最普遍的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化動(dòng)物模型[11-14]。博來霉素的造模給藥途徑有氣管內(nèi)滴入、霧化吸入、腹腔注射和靜脈注射等方式,但各有優(yōu)缺點(diǎn)。

      圖1 多功能內(nèi)窺鏡直視下氣管插管Figure 1 Endotracheal intubation under direct vision

      表1 小鼠肺組織中的生化指標(biāo)Table 1 The lung indexes of mice

      圖2 小鼠肺纖維化的病理變化Figure 2 Pathological changes of pulmonary fibrosis in mice

      Robbe等[15]使用霧化裝置霧化方式吸入博來霉素,誘導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)纖維化。此方法避免了大鼠手術(shù)感染的風(fēng)險(xiǎn),提高了造模成功率及肺內(nèi)博來霉素分布均勻,但此方法消耗的博來霉素量大,不能定量且霧化時(shí)間過長(zhǎng)。有研究[16]報(bào)道采用一次性大劑量和連續(xù)多次小劑量尾靜脈注射博來霉素造模,此方法復(fù)制的動(dòng)物模型更接近于特發(fā)性肺纖維化,但進(jìn)行尾靜脈注射對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作要求較高。此外,腹腔內(nèi)多次注射博來霉素建立的肺纖維化模型[17],亦存在給藥次數(shù)多、劑量大和造模時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

      目前國(guó)內(nèi)外最常用、最受認(rèn)可的是一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化模型[18]。直接灌注法是通過氣管插管向氣管內(nèi)灌注博來霉素,間接灌注法是在動(dòng)物頸部切口,找到氣管后向氣管內(nèi)注入博來霉素。在氣管給藥時(shí),研究者更多采用氣管切開后滴注的方法,但這種方法對(duì)小鼠造成有創(chuàng)損傷,影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及各項(xiàng)生理指標(biāo)。比較以上給藥方式,最理想的是采用無創(chuàng)的方式,一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化,但這種方法操作技術(shù)要求高,需借助一些儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)人員通常利用專門儀器設(shè)備進(jìn)行輔助插管。如Brown 等[19]和Spoelstra 等[20]在專業(yè)喉鏡引導(dǎo)下進(jìn)行氣管插管給藥。Vergari 等[21]利用關(guān)節(jié)鏡對(duì)小鼠進(jìn)行氣管插管,雖然成功率高,損傷小,但是需要特殊設(shè)備,成本高。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)窺鏡輔助下實(shí)施小鼠氣管插管,利用內(nèi)窺鏡探頭冷光源進(jìn)行調(diào)節(jié)光亮度及放大倍數(shù),實(shí)驗(yàn)人員能在內(nèi)窺鏡的面板上更好地觀察咽喉部的結(jié)構(gòu)、小鼠的呼吸頻率及聲門的開啟時(shí)間, 掌握插管的方向, 提高插管的成功率。

      HYP含量能直接反映出結(jié)締組織疾病的膠原代謝情況,通過檢測(cè)組織中HYP含量, 可以判斷組織纖維化程度,還可以對(duì)預(yù)防與治療纖維化藥物的篩選。而MDA 常與SOD 的檢測(cè)相互配合, SOD 的活性高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力, 而MDA的高低則反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。GSH-PX能特異催化還原型谷胱甘肽對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng),起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和維持正常功能的作用。通過此方法建立的小鼠肺纖維化模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠肺組織中HYP、MDA含量, 與對(duì)照組比較, 實(shí)驗(yàn)組含量均增加; 小鼠肺組織中GSH-PX、SOD 活性,與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組含量均降低。小鼠肺組織進(jìn)行病理切片,經(jīng)HE、Masson 染色,顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組膠原纖維沉積嚴(yán)重。從以上生化指標(biāo)及切片結(jié)果顯示,應(yīng)用該氣管插管方法,復(fù)制博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的模型成功率較高,且對(duì)小鼠造成的損傷較小。

      綜上,在多功能內(nèi)窺鏡直視下的小鼠氣管插管方法是一種操作便捷、成功率高、重復(fù)性好、安全性高的插管方法; 可正常通過小鼠口腔觀察氣管,有效地實(shí)現(xiàn)小鼠肺部給藥, 實(shí)驗(yàn)人員只需經(jīng)過數(shù)次練習(xí)即可熟練開展實(shí)驗(yàn),具有一定的優(yōu)越性和實(shí)用價(jià)值,值得推廣應(yīng)用。

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