HPLC法測定喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

劉冊家，王 真，刁瑞麗，岳 蘇，孫珊珊，史 磊

(1.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250103；2.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

喉癥丸由蟾酥(酒制)、人工牛黃、冰片、豬膽汁、玄明粉、青黛等10味中藥經(jīng)提取、濃縮等過程制備而成，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主要用于咽炎、喉炎、扁桃腺炎及一般瘡癤?，F(xiàn)行喉癥丸標準為《部頒標準中藥成方制劑第四冊WS3-B-0848-91》文件，僅有薄層鑒別項目，質量標準檢測項目較為簡單。HPLC具有靈敏度好、分離效率高、易于操作和重復性好的特點。為了符合中藥質量控制現(xiàn)代化的趨勢及要求，本實驗參照藥品質量標準分析方法驗證指導原則[1]，建立了喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的測定方法。方中蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor 或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider 的干燥分泌物，具有解毒、止痛、開竅醒神的功效，可用于治療癰疽疔瘡、咽喉腫痛、中暑神昏、痧脹腹痛吐瀉[2]。現(xiàn)代藥理學研究表明，蟾酥具有極強的鎮(zhèn)痛[3]、強心[4-7]、抗菌[8-10]、抗腫瘤等[11-12]作用，臨床應用廣泛，可用于治療多種惡性腫瘤、慢性乙型肝炎、急慢性呼吸道感染、心臟病等。蟾酥為該處方中的貴重藥材，其有效成分為華蟾酥毒基和脂蟾毒配基，2種成分的含量與該制劑的有效性和安全性密切相關[13]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；CPA225D十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

喉癥丸(山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，批號：1708001、1701002、1703001、1703002、1703003)；華蟾酥毒基(中國食品藥品檢定研究院，批號：110803-201416)、脂蟾毒配基(中國食品藥品檢定研究院，批號：110718-201108)；乙腈(德國默克色譜純)；磷酸二氫鉀(天津市光復科技發(fā)展有限公司)；磷酸(成都市科龍化工試劑廠)；純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.5%磷酸二氫鉀(用磷酸調節(jié)pH=3.2)(40∶60)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長296 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品約15mg，精密稱定，加甲醇分別制成各含華蟾酥毒基48.70、64.94、81.17、97.41、113.64 μg·mL-1和脂蟾毒配基9.23、12.30、15.38、18.45、21.53 μg·mL-1的對照品混合溶液，低溫保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取喉癥丸(1708001)適量，研細，取約0.65 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液制備 取組方中除蟾酥外的其他藥材，參照喉癥丸工藝制法同法小試，制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下的對照品、供試品、陰性供試品溶液各10 μL，按“2.1”項色譜條件進樣分析，在混合對照品溶液出峰位置處，專屬性樣品溶液未出現(xiàn)色譜峰，表明該方法專屬性強。結果見圖1。

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下的5種不同濃度的混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，結果見表1，可知2種成分在各自的范圍內線性關系良好。

圖1 溶液HPLC色譜

表1 2種成分線性關系

2.5 重復性試驗

取喉癥丸樣品(批號：1708001)，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定。測得華蟾酥毒基和脂蟾毒配基平均含量為1.890 mg·g-1、0.983 mg·g-1，RSD為0.5%、0.7%，表明該方法重復性良好。結果見表2。

2.6 中間精密度

選擇與“2.5”項下由不同人員和不同儀器，按“2.1”項下的色譜條件進行測試，測得華蟾酥毒基、脂蟾毒配基平均含量分別為1.895 mg·g-1、0.982 mg·g-1,RSD均為0.7%。結果見表3。

表2 重復性試驗結果

表3 中間精密度試驗結果

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的喉癥丸樣品0.65 g(批號：1708001，華蟾酥毒配基1.890 mg·g-1，脂蟾酥毒配基0.983 mg·g-1)，共6份，分別加入混合對照品溶液(華蟾酥毒基1.081 mg·mL-1，脂蟾毒配基0.792 mg·mL-1)1 mL，按“2.2.2”項下供試品溶液方法制備待測溶液，進樣10 μL，計算回收率。結果華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均回收率分別為101.3%、101.6%，RSD為1.0%、1.2%，準確度結果符合要求。見表4。

2.8 柱溫耐用性考察

取“2.2”項下對照品和該項下方法制備的供試品溶液(批號：1701002)，按“2.1”項下色譜條件下進行柱溫耐用性測定，色譜柱溫度分別設置為38、39、40、41、42 ℃。結果表明在38～42 ℃柱溫條件下，出峰時間隨著溫度的升高而變短，但含量變化不大，供試品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均含量為1.953 mg·g-1、1.060 mg·g-1，RSD分別為0.8%、0.7%。在該溫度條件范圍內對結果無明顯影響，可以滿足檢驗需求。結果見表5。

表4 加樣回收率試驗結果 (n=6)

表5 柱溫耐用性試驗結果

2.9 流速耐用性考察

取“2.2.2”項下對照品和該項下方法制備的供試品溶液(批號：1701002)，按“2.1”項下色譜條件下進行流速耐用性測定，流動相流速分別設置為0.95、0.97、1.00、1.02、1.05 mL·min-1。結果表明在0.95～1.05 mL·min-1流速條件下，流速越小出峰時間越長，但含量變化不明顯，供試品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均含量分別為1.930 mg·g-1、1.086 mg·g-1，RSD均為0.4%。結果見表6。

2.10 樣品測定

取3批不同批號的喉癥丸樣品，按“2.1”項色譜條件進行含量測定，結果見表7。從表中可以看出次3批樣品中各成分的含量與批號1708001樣品含量有差異，這是因為樣品中方劑蟾酥(酒制)原料的投料批次不一致所導致的。

表6 流速耐用性試驗結果

表7 含量測定結果 (mg/g)

3 討論

本研究建立了HPLC測定喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測定方法，在流動相的選取過程中先后采用了乙腈-0.5%磷酸二氫鉀(50∶50)、乙腈-0.5%磷酸二氫鉀(40∶60)等方法，發(fā)現(xiàn)2種成分分離度差、色譜峰拖尾、峰寬等不良的系統(tǒng)適應性。為了達到較好的系統(tǒng)適應性，最終確定了乙腈-0.05%磷酸二氫鉀(40∶60)流動相條件。同時考察了超聲1～2.5 h之間超聲時間對樣品含量的影響，結果表明含量變化微小，故選擇超聲1h的提樣時間。

用該方法測定3批喉癥丸樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，實驗結果表明，本方法簡單易行，重復性好，能夠準確地用于喉癥丸蟾酥含量控制，為喉癥丸的原料和產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支持和技術保障。故該實驗條件下的高效液相色譜法可作為喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量測定的方法。