HPLC-DAD-Q-TOF-MS在線篩選鑒定牛蒡中的抗氧化成分

鄭振佳，張瑞凌，張敏敏，邱志常，張 斌，喬旭光,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 泰安 271018；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 濟(jì)南 250014）

牛蒡（Arctium lappa L.）為菊科兩年生草本植物，《本草綱目》記載其“久服輕身耐老”[1]，現(xiàn)代研究證明牛蒡具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤、降血糖等活性[2-4]，對高血壓、糖尿病、動脈硬化等疾病具有治療作用[5-7]。牛蒡提取物具有很好的抗氧化作用，可以有效清除自由基、提高超氧化物歧化酶活性、抑制脂質(zhì)體和蛋白質(zhì)的氧化損傷并與VE形成協(xié)同作用增強(qiáng)抗氧化性[8-13]。牛蒡中具有抗氧化活性的化合物主要為咖啡?？鼘幩犷惡忘S酮類化合物，其中咖啡?？鼘幩犷惢衔锏膱蟮肋h(yuǎn)多于黃酮，是牛蒡中主要的次級代謝產(chǎn)物[14-17]?？Х弱？鼘幩犷惢衔飳儆诳Х人岬难苌?，主要存在牛蒡乙酯相中，該化合物具有明顯的抗氧化作用[18-19]，對氧化應(yīng)激引起的缺血性損傷、肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和胰島素抵抗等癥狀具有明顯改善作用[20-23]，是牛蒡中最重要的一類活性成分。先前的研究通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對牛蒡中該成分進(jìn)行分析[24-25]，分析過程僅依據(jù)分子質(zhì)量進(jìn)行推斷，并未經(jīng)對照品進(jìn)行驗證，因此鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步考證。

基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）模型建立的高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜法已成為天然產(chǎn)物研究中抗氧化活性成分篩選的重要方法之一[26-29]，樣品中的抗氧化活性成分與DPPH-甲醇溶液反應(yīng)后進(jìn)入紫外檢測器，由于自由基的清除導(dǎo)致在517 nm波長處在線檢測形成負(fù)峰。通過DPPH模型中出現(xiàn)的負(fù)吸收峰結(jié)合化合物的紫外吸收和精準(zhǔn)分子質(zhì)量，可以快速、定向和準(zhǔn)確鑒定樣品中的抗氧化成分。

本研究以牛蒡提取物的乙酸乙酯相為研究對象，基于DPPH篩選模型建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器-串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-DAD-Q-TOF-MS）在線篩選鑒別自由基清除劑的方法對牛蒡中天然抗氧化活性成分進(jìn)行快速篩選和鑒定，為食品及中藥等復(fù)雜體系中抗氧化活性成分的篩選提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡購于江蘇沛縣軼偉食品有限公司，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的根，品種為柳川理想。

DPPH 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 瑞士Oceanpak公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配置DAD）、G6520A Q-TOF-MS（配置電子電離源） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液及DPPH-甲醇溶液制備

牛蒡干燥粉碎后過80 目篩，稱取2.0 g牛蒡樣品，100 mL 50%乙醇溶液回流提取30 min，抽濾后低壓濃縮至無明顯醇味后用純水定容至10 mL，依次用3 倍體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取相蒸干，分別用50%乙腈溶液定容至2 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜，備用。

準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為6×10-5mol/L甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3.2 抗氧化成分在線篩選與鑒別

圖 1 抗氧化成分在線篩選與鑒別流程圖Fig. 1 Flow chart of on-line screening for and identification of antioxidant compounds

實(shí)驗流程見圖1。待測樣品經(jīng)HPLC-1分離通過經(jīng)分流閥分成2 部分，一部分進(jìn)入混合器，與HPLC-2泵入的DPPH-甲醇溶液混合反應(yīng)后進(jìn)入DAD，在517 nm波長處形成的負(fù)峰即為抗氧化成分；另一部分進(jìn)入DAD和MS儀，實(shí)現(xiàn)各成分的紫外吸收檢測以及各成分的在線質(zhì)譜分析。負(fù)峰色譜圖結(jié)合精準(zhǔn)的分子質(zhì)量信息與紫外吸收特征，實(shí)現(xiàn)牛蒡中抗氧化成分的在線快速篩選。

1.3.3 儀器工作條件

HPLC-1工作條件：色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫程序：0～7 min（15% A），7～8 min（15%～20% A），8～29 min（20% A），29～30 min（20%～25% A），30～50 min（25%～30% A）；流速1 mL/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃。樣品經(jīng)HPLC-1色譜柱后分流至DAD-Q-TOF-MS流速為0.3 mL/min，另一路液體流速為0.7 mL/min。

HPLC-2工作條件：反應(yīng)器為PEEK盤管（10 m×0.254 mm）；流動相為DPPH-甲醇溶液，流速0.5 mL/min，檢測波長517 nm。

HPLC-1的正峰色譜圖和HPLC-2的負(fù)峰色譜圖由Agilent液相色譜化學(xué)工作站同時獲得。

質(zhì)譜工作條件：分別采用電噴霧正、負(fù)離子模式；全掃描范圍m/z 100～1 000；毛細(xì)管電壓4.5 kV；霧化氣壓力35 psi；干燥氣流速10.0 L/min；干燥氣溫度325 ℃；裂解電壓100 V；錐孔電壓60 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡抗氧化成分提取結(jié)果

本實(shí)驗分別考察50%乙醇溶液超聲提取和回流提取2 種方式對牛蒡化學(xué)成分的提取效果，結(jié)果表明回流提取30 min的效果優(yōu)于200 W超聲提取1.5 h，故采用回流方式進(jìn)行提取。提取濃縮后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，通過HPLC對牛蒡的不同萃取部位分析比對，結(jié)果見圖2。石油醚相（圖2A）、乙酸乙酯相（圖2B）和正丁醇相（圖2C）差異較大，說明采用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取富集的前處理過程初步實(shí)現(xiàn)牛蒡化學(xué)成分的分段富集與凈化。從圖2可以看出，乙酸乙酯相的HPLC圖與回流提取總樣最為接近，所以將乙酸乙酯相作為后續(xù)的分析對象。

圖 2 牛蒡不同相液相色譜圖Fig. 2 Chromatograms of different solvent extracts of burdock

2.2 HPLC條件優(yōu)化結(jié)果

分別考察乙腈-0.1%甲酸溶液和甲醇-0.1%甲酸溶液2 種流動相對目標(biāo)物的分離效果，結(jié)果表明，在實(shí)現(xiàn)較好分離的目標(biāo)下，乙腈-0.1%甲酸溶液體系洗脫時間為50 min，甲醇-0.1%甲酸溶液體系洗脫時間為70 min，且前者的分離效果優(yōu)于后者。在同一HPLC條件和色譜柱規(guī)格（250 mm×4.6 mm，5 μm）下，分別考察Phenomenex Gemini-NX C18、YMC-Pack ODS-A、Waters Symmetry C18和Spax Amethyst C18-H四種不同色譜柱對于目標(biāo)物的分離效果。經(jīng)實(shí)驗比較，Phenomenex Gemini-NX C18色譜柱的分離效果最佳，因此選取該色譜柱作為分析色譜柱，樣品HPLC分析結(jié)果見圖3。

圖 3 牛蒡提取物HPLC圖Fig. 3 HPLC of burdock extract

2.3 抗氧化活性成分在線篩選結(jié)果

圖 4 牛蒡提取物在線清除自由基HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of burdock extract and on-line screening for free radical scavengers

DPPH濃度是影響篩選靈敏度的一個重要因素，信噪比隨著濃度的增加而相應(yīng)增加，同時基線噪音和基線波動也隨之增大。研究分別考察2×10-4、1×10-5mol/L和6×10-5mol/L三個濃度下的篩選效果，結(jié)果表明DPPH-甲醇溶液濃度為6×10-5mol/L時的篩選效果最佳，因此選取該濃度作為篩選濃度，自由基清除劑篩選結(jié)果見圖4。

2.4 紫外吸收情況考察結(jié)果

利用DAD對樣品中峰面積相對含量在0.5%以上且具有抗氧化活性的化合物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見表1。從全波長掃描結(jié)果來看，該樣品中具有抗氧化活性化合物的紫外吸收情況具有高度相似性，主要成分的紫外吸收最大波長在216、240 nm和320 nm附近，初步判斷為結(jié)構(gòu)類似物，且樣品中大多數(shù)化合物在300 nm波長處有特征肩峰，判定為咖啡酰奎寧酸類系列化合物。

表 1 牛蒡提取物的HPLC-DAD-Q-TOF-MS測量結(jié)果Table 1 Analytical data from HPLC-DAD-Q-TOF-MS for burdock extract

2.5 MS條件優(yōu)化結(jié)果

分別考察正離子和負(fù)離子模式下待測樣品的總離子流圖，由圖5可以看出，待測組分在負(fù)離子模式下響應(yīng)值優(yōu)于正離子模式，雜質(zhì)的干擾程度低于正離子模式，因此選取負(fù)離子模式為質(zhì)譜檢測條件。

圖 5 正（A）、負(fù)（B）離子模式下總離子流圖Fig. 5 Total ion current chromatograms of burdock extract in the positive (A) and negative ion (B) modes

2.6 抗氧化成分的Q-TOF-MS鑒別

在優(yōu)化HPLC條件下，采用Q-TOF-MS技術(shù)對目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒別。根據(jù)獲得化合物的精確分子質(zhì)量信息與DAD獲得的紫外吸收信息，對相對含量0.5%以上的咖啡酸及其衍生物進(jìn)行鑒別，結(jié)果見表1。參考文獻(xiàn)[30-32]并與山東省分析測試中心國家天然產(chǎn)物參比實(shí)驗室自有的綠原酸、咖啡酸、1,5-O-二咖啡酰奎寧酸、綠原酸甲酯、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、1,3-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀?？鼘幩峁? 種對照品進(jìn)行比對，對照品的色譜峰分別對應(yīng)圖3中的峰1、2、3、4、6、7、8、11和峰12共9 個化合物。峰5、9和峰10分子質(zhì)量相同，根據(jù)極性大小和二咖啡酰奎寧酸的出峰順序推斷峰5為1,5-O-二咖啡酰-3-O-蘋果?？鼘幩幔?為3,4-O-二咖啡酰-3-O-蘋果?？鼘幩幔?0為3,5-O-二咖啡酰-3-O-蘋果?？鼘幩帷７?3分子質(zhì)量與峰5、峰9和峰10相差14，相差的基團(tuán)為—CH2—，根據(jù)參考文獻(xiàn)[33]和已發(fā)現(xiàn)化合物的信息推斷峰13為1,5-O-二咖啡酰-3-O-蘋果酸甲酯奎寧酸。峰15為二咖啡?？鼘幩峒柞ィY選范圍為1,3-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞ズ?,5-O-二咖啡?？鼘幩峒柞ブ械囊环N，考慮到成鍵的順序和甲酯基團(tuán)引起的極性差異，推斷該化合物為3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒柞?。峰14和峰16相對分子質(zhì)量相差14，相差的基團(tuán)為—CH2—，從已發(fā)現(xiàn)琥珀酸在類似結(jié)構(gòu)中的取代情況推斷峰14為1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀?？鼘幩?，峰16為1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰甲酯奎寧酸。峰17為三咖啡酰-奎寧酸乙酯，峰18、19分別為三咖啡酰-蘋果?？鼘幩岷腿Х弱?琥珀?？鼘幩岬耐之悩?gòu)體，由于三咖啡酰-奎寧酸化合物目前發(fā)現(xiàn)有1,3,5-O-三咖啡?？鼘幩?、1,4,5-O-三咖啡?？鼘幩岷?,4,5-O-三咖啡?？鼘幩? 種，結(jié)構(gòu)中可結(jié)合蘋果酸和琥珀酸的羥基較多，難以確定具體結(jié)合位點(diǎn)，因此峰17～19只能歸屬到三咖啡?？鼘幩犷惢衔镅苌锏姆懂?。

3 結(jié) 論

本研究建立在線篩選鑒定抗氧化活性成分方法，實(shí)現(xiàn)牛蒡乙酸乙酯相中抗氧化活性成分的在線篩選與鑒定，結(jié)果顯示牛蒡中重要的抗氧化成分主要為咖啡?？鼘幩犷惢衔?。本方法快速、準(zhǔn)確，與紫外分光光度計法和傳統(tǒng)天然產(chǎn)物中復(fù)雜成分的分離與鑒別模式相比，具有更高的篩選效率；與前期的MS鑒定方法比較，新增活性篩查以及采用部分對照品進(jìn)行確證，從而保證結(jié)果更加準(zhǔn)確。由于咖啡酰奎寧酸類化合物結(jié)構(gòu)類似且存在多種同分異構(gòu)體，在無對照品的前提下，即使通過多級質(zhì)譜也難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。對于未明確具體名稱的咖啡酰奎寧酸類化合物，需在后期研究中通過多種色譜技術(shù)制備獲得高純度單體，結(jié)合核磁共振二維譜實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)確證。