L-阿拉伯糖與氨基酸美拉德反應揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

馮 濤，趙 宇，張治文，莊海寧，宋詩清，姚凌云，孫 敏，徐志民

（1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海 201403；3.美國路易斯安那州立大學食品科學系，美國 路易斯安那 巴吞魯日 70802）

美拉德反應由法國著名化學家Maillard L C于1912年發(fā)現(xiàn)并命名[1]，是廣泛存在于食品工業(yè)的一種非酶褐變，又稱為“非酶棕色化反應”。該反應是羰基化合物和氨基化合物經(jīng)過復雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素，故又稱其為羰氨反應[2-3]。

L-阿拉伯糖是一種低熱量甜味劑，可抑制腸道內(nèi)蔗糖酶的活性，減少蔗糖吸收，有效減少體內(nèi)糖含量[4]。此外，L-阿拉伯糖還可抑制脂肪堆積，用于防治肥胖、高血壓、高血脂等疾病[5-6]。日本厚生省將L-阿拉伯糖列入“調(diào)節(jié)血糖的專用特殊保健食品添加劑”；美國醫(yī)療協(xié)會將L-阿拉伯糖列入“抗肥胖的營養(yǎng)補充劑或非處方藥”；2008年我國衛(wèi)生部正式批準L-阿拉伯糖為新資源食品，確認其在功能糖領域的重要地位[7]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖的反應型香精香氣柔和、豐富，賦予使用香精終端產(chǎn)品以更接近自然和飽滿的香氣，許多國際香精公司開始研究使用L-阿拉伯糖生產(chǎn)反應型香精，如美國Danisco公司已有L-阿拉伯糖CT98和L-阿拉伯糖糖漿2 種產(chǎn)品作為反應型香精的生產(chǎn)原料供應國際市場。為提高飲食健康，減少肥胖、高血壓等疾病的干擾，采用L-阿拉伯糖為原料生產(chǎn)反應型甜味香精將成為一種新的健康飲食方式。

通常以葡萄糖、果糖、木糖等還原糖作為美拉德反應原料制備風味物質(zhì)，而用L-阿拉伯糖作為美拉德反應原料制備風味物質(zhì)的實驗卻鮮有涉及。如周向軍等[8]則以甘氨酸-果糖、精氨酸-果糖為原料制備美拉德反應產(chǎn)物。周志磊等[9]用葡萄糖、果糖與脯氨酸發(fā)生美拉德反應，產(chǎn)生具有焦甜香的風味化合物，如2-乙酰呋喃、菠蘿酮和5-乙基麥芽酚。Wong等[10]研究酸性條件下葡萄糖與17 種氨基酸美拉德反應的呈味情況，研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和纈氨酸與葡萄糖反應可產(chǎn)生焦甜香；脯氨酸產(chǎn)生花香；丙氨酸產(chǎn)生水果香和花香；絲氨酸產(chǎn)生水果香等。

本實驗在先前研究[11]的基礎上，采用L-阿拉伯糖與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸在不同條件下發(fā)生美拉德反應生成反應型甜味香精，并分析比較其風味特征，為開發(fā)以L-阿拉伯糖為原料的甜味香精提供思路、借鑒和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-阿拉伯糖（食品級） 濟南圣泉唐和唐生物科技有限公司；丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸（食品級）河南潤誠食品配料有限公司；2-辛醇（內(nèi)標，色譜級標準品） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；正構烷烴（C7～C30）、2,5-二甲基吡嗪、2,6二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5甲基吡嗪（色譜級標準品） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ML104電子分析天平、FiveEsay Plus pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-11-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）頭 上海安譜實驗科技股份有限公司；HP-INNOWAX毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890 GC-5973C MS氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司；DF-101S熱恒溫油浴鍋 上海喬躍電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應產(chǎn)物的制備

按分組比例準確稱取L-阿拉伯糖與甘氨酸共2 g后倒入三口燒瓶中，然后向錐形瓶中添加20% 1,2-丙二醇溶液23 mL后振蕩搖勻并加熱制備美拉德反應香精。第1組：L-阿拉伯糖與丙氨酸美拉德反應條件[11-14]：pH 9.42，溫度80 ℃，L-阿拉伯糖∶丙氨酸0.3∶1，反應時間86 min；第2組：L-阿拉伯糖與甘氨酸美拉德反應條件：pH 9.13，溫度81 ℃，L-阿拉伯糖∶甘氨酸3∶1，反應時間53 min；第3組：L-阿拉伯糖與蘇氨酸美拉德反應條件：pH 9.26，溫度80 ℃，L-阿拉伯糖∶蘇氨酸0.33∶1，反應時間50 min；第4組：L-阿拉伯糖與絲氨酸美拉德反應條件：pH 8.13，溫度81 ℃，L-阿拉伯糖∶絲氨酸0.90∶1，反應時間51 min。

1.3.2 香氣物質(zhì)SPME與GC-MS檢測

用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進行SPME。在15 mL頂空瓶中加入7 mL反應香精，5 μL 2-辛醇，插入萃取頭，60 ℃平衡15 min后萃取30 min，250 ℃ GC解吸5 min，進行GC-MS分析[15-16]。

毛細管色譜柱型號：Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；采用不分流進樣模式；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃，質(zhì)譜接口溫度250 ℃，掃描范圍m/z 30～450[17-18]。

升溫程序：進樣口250 ℃，柱初溫40 ℃，保留6 min，以8 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保留20 min。

1.3.3 香氣物質(zhì)的定性與定量

定性：通過檢出物質(zhì)譜圖和NIST 05a.l、Wiley 7n.l數(shù)據(jù)庫（美國Agilent公司）中標準譜圖的比對；通過與標準品保留時間對比；與標準品的保留指數(shù)（retention index，RI）進行比對，沒有標準品的，與已報道文獻中RI進行比對。RI根據(jù)計算得到，按照樣品分析方法，取0.2 μL正構烷烴（C7～C30）混標注入GC-MS，通過烷烴混標的保留時間與樣品中揮發(fā)性成分的保留時間計算未知化合物的RI，計算見式（1）：

式中：RIX為未知化合物X的RI；tX為未知化合物X的保留時間；tZ、tZ+1為未知化合物相鄰前后的2 個正構烷烴的保留時間；Z為未知化合物X出現(xiàn)之前的正構烷烴的碳原子數(shù)。

定量：對于香氣活性值（odor activity value，OAV）大于1的物質(zhì)，采用內(nèi)標標準曲線法進行定量。以預測組分標準品與內(nèi)標物的響應值之比為縱坐標、標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，得到內(nèi)標標準工作曲線。通過標準曲線計算預測組分含量[19]。采用內(nèi)標法對反應香精中的香氣化合物進行定量，按照公式（2）進行計算：

式中：CX為未知化合物X質(zhì)量濃度/（μg/L）；f為校正因子（將校正因子設為1）；CO為內(nèi)標2-辛醇質(zhì)量濃度/（μg/L）；AX、AO分別為未知化合物X的峰面積和內(nèi)標2-辛醇的峰面積。1.3.4 感官評價

參照食品感官評價原理與技術[20-22]，由8 名接受過專業(yè)感官培訓的成員組成感官評價小組，年齡均在23～28 歲之間。將需嗅聞的產(chǎn)品進行隨機編碼，并水浴加熱至30 ℃后進行嗅覺感官評價（烤香、青香、花果香、可可香）。采用10 分評分制，最后得分為各香氣得分平均值。

1.3.5 OAV計算

OAV定義為香氣化合物的含量與其在水中閾值的比值[23]，根據(jù)公式（3）[24]計算：

式中：F為樣品中香氣化合物質(zhì)量濃度；T為香氣化合物的閾值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0進行主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA相關數(shù)據(jù)進行中心化與標準化（1/Sdev）處理，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風味化合物分析結(jié)果

由表1可知，L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生可可、烤香的風味。風味化合物為2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪。其中尤為突出的風味化合物為2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。L-阿拉伯糖分別與蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生帶有青香風味的化合物薄荷酮。L-阿拉伯糖與丙氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生帶有花果香的風味化合物5-茚醇。

表 1 反應香精揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of volatile components of Maillard reaction products (MRPs)

2.2 感官評價分析

表 2 各香氣感官評價結(jié)果Table 2 Sensory scores for intensity of aromas of MRPs

由表2可知，L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應均產(chǎn)生強烈的烤香和可可香。L-阿拉伯糖分別與蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生中等強度的青香，相比之下L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸反應產(chǎn)生的青香較弱。L-阿拉伯糖與丙氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生中等強度的花果香。

2.3 關鍵揮發(fā)性風味化合物鑒定結(jié)果

若僅通過揮發(fā)性風味化合物含量確定香氣的貢獻度，并不能準確反映其對于美拉德反應產(chǎn)物香氣的貢獻程度，故而采用OAV討論美拉德反應產(chǎn)物中關鍵的揮發(fā)性風味物質(zhì)。OAV＞1，香氣貢獻明顯，OAV越大則貢獻程度越大。OAV＜1，該風味物質(zhì)不是關鍵風味物質(zhì)，在產(chǎn)物中起協(xié)香作用。

對GC-MS檢測結(jié)果計算OAV，結(jié)果如表3所示（可查詢閾值物質(zhì)），其中有7 種物質(zhì)OAV大于1，這些物質(zhì)被認為是美拉德反應產(chǎn)物的關鍵組分。其中6 種物質(zhì)為吡嗪類物質(zhì)，主要的風味特征為烤香和可可香。這與感官評價所得結(jié)果相似，感官評價中主要的感官屬性為烤香和可可香。由表3可知，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪OAV較大，故為美拉德反應產(chǎn)物中最關鍵的風味物質(zhì)。

在檢測到的風味化合物中薄荷酮具有特有的青香風味，雖不是關鍵性風味物質(zhì)，但仍能在反應產(chǎn)物中嗅聞到青香的風味。L-阿拉伯糖和蘇氨酸的美拉德反應產(chǎn)物中可嗅聞到淡淡的青香風味，但其他反應產(chǎn)物中青香味不明顯。

表 3 反應香精中揮發(fā)性物質(zhì)的OAVTable 3 OAV of volatile components of MRPs

2.4 揮發(fā)性化合物PCA

如圖1所示，在第1象限中，與B4（可可香）相關的風味化合物為C9（2-乙基-6-甲基吡嗪）、C11（2,3,5-三甲基吡嗪）、C12（3-乙基-2,5-二甲基吡嗪）。由此可知C9、C11、C12主要貢獻可可風味。在第2象限中，與S3（L-阿拉伯糖與蘇氨酸美拉德反應產(chǎn)物）相關的感官屬性為B2（青香），相關的風味化合物為C15（薄荷酮）。第4象限中，與S1（L-阿拉伯糖與丙氨酸美拉德反應產(chǎn)物）相關感官屬性為B1（烤香）和B3（花果香），相關的風味化合物為C1（丙酮）、C4（2-甲基吡嗪）、C5（2,5-二甲基吡嗪）、C7（2-乙基吡嗪）、C10（2-乙基-5-甲基吡嗪）、C13（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪）、C14（2-乙?；拎ぃ?。其中C4、C5、C7、C10、C13主要貢獻烤香的風味，C1主要貢獻花果香。

圖 1 16 種揮發(fā)性風味化合物PCAFig. 1 PCA plot for 16 volatile flavor compounds

綜合圖1可知，產(chǎn)生烤香風味的C4、C5、C7、C10、C13與S1相關性較高。而由2.1節(jié)可知S2、S3、S4中也含有C4、C5、C10且含量較大，但低于S1中含量。綜合考慮可知S1產(chǎn)生的烤香最為濃厚，此結(jié)果與感官評價結(jié)果相同。產(chǎn)生花果香的5-茚醇僅存在于S1中，故S1中有花果香。產(chǎn)生青香的C15在S3中含量較高，且C15與S3相關性較高，故S3中青香味較其他物質(zhì)中青香味大。

3 結(jié)論與討論

由于美拉德反應受pH值影響較大，尤其在pH值大于9的情況下會產(chǎn)生大量吡嗪類物質(zhì)[26-28]。在L-阿拉伯糖與4 種氨基酸反應的美拉德產(chǎn)物中，產(chǎn)生的2,5-二甲基吡嗪含量最多，其為美拉德反應常見生成產(chǎn)物[29-32]。

L-阿拉伯糖與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應均可產(chǎn)生強烈的烤香、可可香風味物質(zhì)，如2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪，且風味貢獻度較高，適用于添加到可可、咖啡、巧克力中。L-阿拉伯糖與蘇氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生帶有淡淡的青香風味物質(zhì)薄荷酮，適用于添加到飲料、香煙和糖果中。L-阿拉伯糖與丙氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生帶有微弱的花果香風味物質(zhì)5-茚醇、丙酮。本實驗探究L-阿拉伯糖分別與丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸發(fā)生美拉德反應生成的甜味香精揮發(fā)性風味化合物，并分析比較風味特征及對其主要風味物質(zhì)的反應機理進行探討，為今后甜味香精的開發(fā)提供新的方向。