司海明 ， 韓瑞枝 ， 許國超 ， 董晉軍 ， 倪 曄 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇 無錫214122）

現(xiàn)代工業(yè)飛速發(fā)展的同時，隨之出現(xiàn)了一系列問題，例如化石燃料（煤炭、石油等）極度消耗，環(huán)境污染日益加劇，霧霾現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重。為此，人們將關(guān)注焦點逐漸從化石能源轉(zhuǎn)移至生物能源的開發(fā)和利用上，例如利用微生物生產(chǎn)乙醇和丁醇等生物燃料。但是，大多數(shù)有機溶劑對微生物細(xì)胞生長有抑制作用。它們能夠破壞細(xì)胞膜、改變胞內(nèi)pH、引發(fā)胞內(nèi)離子和代謝物質(zhì)的丟失和蛋白的錯誤折疊，導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡[1]。因此，構(gòu)建具有較高有機溶劑耐受性的微生物菌株對生物能源的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。丁醇作為一種新型的、可再生的生物燃料，具有熱值高，腐蝕性小和抗爆性好等優(yōu)點[2-4]。傳統(tǒng)的丁醇生產(chǎn)菌株梭菌因其培養(yǎng)方式嚴(yán)格厭氧，代謝調(diào)控復(fù)雜，分子操作困難[5-7]，嚴(yán)重限制了微生物工業(yè)生產(chǎn)丁醇的經(jīng)濟性。大腸桿菌因其遺傳背景清晰，分子操作簡單，更有利于應(yīng)用于丁醇的工業(yè)生產(chǎn)。但是由于大腸桿菌的溶劑耐受性較低，在體積分?jǐn)?shù)1%丁醇壓力下就停止生長[8]。因此提高大腸桿菌的丁醇耐受性是提高丁醇產(chǎn)量的前提。

傳統(tǒng)研究中，人們通過有機溶劑馴化，物理或化學(xué)誘變的方法獲得溶劑耐受性菌株，但是這些方法耗時耗力而且獲得的效果也微乎其微[9-10]。隨著后基因組時代的發(fā)展，眾多研究者更多地采用代謝工程手段以及從基因組全局水平出發(fā)研究微生物表型與基因組轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)系。2006年，Alper等首次提出全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制 （global transcription machinery engineering，gTME）的概念，指出全局轉(zhuǎn)錄因子可以直接或者間接的調(diào)控大腸桿菌內(nèi)大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄水平[11]。近年來，有一些通過對全局轉(zhuǎn)錄因子操縱來改造微生物表型的報道。有報道通過對全局轉(zhuǎn)錄因子cAMP受體蛋白（CRP）進行隨機突變得到能夠耐受體積分?jǐn)?shù)1.2%丁醇的大腸桿菌[12]。Hong等對大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子Hha突變來調(diào)控生物被膜的形成，從而降低微生物的致病性[13]。也有研究者通過對Saccharomyces cerevisiae中全局轉(zhuǎn)錄因子spt15進行突變，提高酵母菌株對木糖的耐受及利用率[14]。σ70全局轉(zhuǎn)錄因子作為大腸桿菌RNA聚合酶的一個亞基，其突變能夠影響RNA聚合酶對啟動子的識別，從而對大腸桿菌基因組中上千個基因的轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控[15-16]。Alper等通過突變大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子σ70的編碼基因rpoD，將大腸桿菌的乙醇耐受性提高至70 g/L[17]。

作者通過隨機突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子σ70篩選獲得一株能夠耐受體積分?jǐn)?shù)2%丁醇的大腸桿菌E.coli JM109/pHACMB8，其攜帶有rpoD突變基因B8，命名為突變株B8。該突變株也能夠耐受多種不同毒性的有機溶劑，如異丁醇，乙醇，環(huán)己烷，甲苯。通過比較對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變株B8的生理特性，發(fā)現(xiàn)突變菌株B8較對照菌株E.coli JM109/pHACMWT胞內(nèi)的丁醇含量降低，且具有較好的低pH耐受性。此外，向培養(yǎng)基中添加Mg2+有助于提高突變株B8對丁醇的耐受性。該研究為選育具有耐丁醇表型的微生物菌株奠定了基礎(chǔ)并提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 菌株：E.coli JM109為本實驗室保藏；質(zhì)粒：攜帶了野生型rpoD基因的pHACM質(zhì)粒由清華大學(xué)于慧敏教授惠贈。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。必要時添加氯霉素 34 μg/mL。

LBGMg：在 LB培養(yǎng)基中添加10 mmol/L的MgSO4和1 g/L的葡萄糖。

1.1.2 酶、試劑、引物及相關(guān)試劑盒 正丁醇：購于國藥集團；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker、高保真酶：購自TaKaRa公司；隨機突變試劑盒（GeneMorph II Random Mutagenesis Kit）：安捷倫科技有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；測序由賽音生物技術(shù)（上海）有限公司完成。實驗中所用引物為p-rpoD-F5′-AACCTAGGAGCTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCG AAGAGC-3′和 p-rpoD-R5′-TGGAAGCTTTAACG CCTGATCCGGCCTACCGATTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 σ70隨機突變庫的構(gòu)建 利用隨機突變試劑盒，以攜帶有rpoD基因的質(zhì)粒pHACM為模板，以p-rpoD-F、p-rpoD-R為引物對rpoD （編碼σ70轉(zhuǎn)錄因子）進行隨機突變。PCR條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 2 min， 反應(yīng) 30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。對突變后的rpoD片段經(jīng)凝膠電泳后切膠回收，以純化后的rpoD片段為引物對pHACM進行全質(zhì)粒大引物PCR。反應(yīng)結(jié)束后向PCR產(chǎn)物中加入DpnI酶消化模板質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后切膠回收。回收后的質(zhì)粒按照常規(guī)熱激方法，轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，同時將未突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞后獲得的菌株作為對照菌。37℃后培養(yǎng)1.5 h后涂布氯霉素固體平板中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，即獲得rpoD隨機突變庫。隨機挑取10個單菌落于液體LB/Cm培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，分別提取其質(zhì)粒并送至測序公司進行rpoD基因測序，將測序結(jié)果與野生型rpoD進行序列比對，初步計算突變庫中rpoD的突變率。

1.2.2 丁醇耐受突變株的篩選 第一輪篩選：為獲得一株具有較高丁醇耐受的大腸桿菌突變株，將1.2.1中構(gòu)建的隨機突變庫中的單菌落接種于含有LB/Cm液體培養(yǎng)基的24深孔板中，當(dāng)OD660≈0.2時，向培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)0.5%丁醇，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后分別測定菌體在OD660時的濃度。選取OD660較高的前10株突變株進行復(fù)篩，復(fù)篩過程中以體積分?jǐn)?shù)0.1%的梯度不斷提高培養(yǎng)基中丁醇的體積分?jǐn)?shù)，直到獲得一株具有最高丁醇耐受性的菌株D3。提取其質(zhì)粒進行測序，然后重新轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，驗證其最大丁醇耐受體積分?jǐn)?shù)。

第二輪篩選：為進一步提高大腸桿菌的丁醇耐受性，以攜帶有rpoD突變基因D3的質(zhì)粒為模板，按照1.2.1的方法再次構(gòu)建隨機突變庫，按照一輪篩選的方法進行二輪篩選，直至獲得一株最高丁醇耐受性的突變株B8，提取其質(zhì)粒進行測序。

1.2.3 突變株B8丁醇耐受性評估及驗證 評估：以體積分?jǐn)?shù)1.2%作為培養(yǎng)基中丁醇的起始體積分?jǐn)?shù)，并按體積分?jǐn)?shù)0.1%梯度逐步提高培養(yǎng)基中的丁醇體積分?jǐn)?shù)，直至B8菌濃不再增加，從而確定其對丁醇的極限耐受體積分?jǐn)?shù)。

驗證：對篩選獲得的丁醇耐受突變株提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化E.coli JM109細(xì)胞中，以未突變的菌株作為對照，在體積分?jǐn)?shù)2%丁醇下37℃培養(yǎng)，每小時檢測OD660，驗證菌株的丁醇耐受能力，以排除馴化的影響。

1.2.4 丁醇耐受突變株B8對其他有機溶劑的耐受性 取過夜培養(yǎng)的菌液按2%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接于LB/Cm液體培養(yǎng)基中，待OD660約為0.2時，分別向液體培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)的異丁醇、乙醇、環(huán)己烷、甲苯，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，分別測定含不同有機溶劑培養(yǎng)基中的菌體濃度（OD660）。

1.2.5 胞內(nèi)丁醇含量的測定 將生長至對數(shù)期的對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變菌株B8在體積分?jǐn)?shù)0.8%丁醇的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h。取菌液以8 000 r/min，4℃離心10 min，再用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌細(xì)胞一次，離心獲得濕菌體。用750 mg/L的溶菌酶進行破壁后，離心取上清液2 μL，進行氣相檢測。氣相條件為：安捷倫氣相色譜儀配合PEG20M毛細(xì)管柱 （30 m×0.32 mm×0.5 μm）；N2作為載氣； 柱溫從60℃升至120℃，10℃/min，再以15℃/min的速度升至190℃，保留10 min。胞內(nèi)丁醇含量以μg/mg濕細(xì)胞表示。

1.2.6 突變株B8對不同pH的耐受 將過夜培養(yǎng)的對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變菌株B8按2%的接種體積分?jǐn)?shù)分別轉(zhuǎn)接于不同pH的LB/Cm液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后測定對照菌株和突變菌株的OD660值。

1.2.7 Mg2+對B8耐受性的影響 將過夜培養(yǎng)的對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變菌株B8按2%的接種體積分?jǐn)?shù)分別轉(zhuǎn)接于LBG/Cm和LBGMg液體培養(yǎng)基中，待OD660約為0.2時，分別向液體培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)0.5%的丁醇。通過每小時測定OD660的值檢測菌株的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 σ70隨機突變庫的構(gòu)建

利用隨機突變試劑盒，對質(zhì)粒pHACM上攜帶的rpoD（σ70的編碼基因）進行隨機突變。結(jié)果見圖1（a）。在2 000 bp處有條帶，符合rpoD片段的理論值大小。對rpoD片段純化回收，以此為引物，pHACM為模板進行大質(zhì)粒PCR，獲得大小為6 000 bp的片段，結(jié)果如圖1（b）。對獲得的質(zhì)粒用DpnI酶消化后，熱轉(zhuǎn)至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，通過LB/Cm平板篩選獲得約106基因突變庫。隨機挑取10株菌進行測序，結(jié)果顯示全部突變，所構(gòu)建的突變庫的突變率為2～7個核苷酸突變/基因。

圖1 隨機突變后的rpoD片段和全質(zhì)粒擴增后的pHACM-rpoD質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of rpoDMand pHACM-rpoDM

2.2 丁醇耐受突變株的篩選

為了有效提高大腸桿菌對丁醇的耐受性，我們進行了兩輪隨機突變。在第一輪突變過程中，從483突變株中篩選獲得10株在體積分?jǐn)?shù)0.5%丁醇壓力下生長較快的菌株（OD660＞1.0）。對這10株菌進一步丁醇梯度篩選（體積分?jǐn)?shù)0.1%梯度逐步提高），結(jié)果顯示當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)達到1.2%時，突變株D3長勢最好，OD660達到了0.76，其他9株突變株和對照菌株OD660均低于0.6（圖2（a））。 提取突變株D3的質(zhì)粒，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)rpoD基因中兩個堿基發(fā)生了突變，相應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镮41L、P97Q。

為了獲得更高丁醇耐受性的大腸桿菌，我們以突變株D3的質(zhì)粒為模板，進行第二輪突變。在483突變株中有8株菌的OD660明顯高于其他突變株。將這8株菌在丁醇體積分?jǐn)?shù)0.1%梯度遞增的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)B8在體積分?jǐn)?shù)1.2%丁醇下OD660達到了 1.4，其他菌株 OD660＜1.0（圖 2（b））。 同時提取了突變株B8的質(zhì)粒進行測序，發(fā)現(xiàn)在前面氨基酸突變的基礎(chǔ)上，又增加了E57D這個位點的突變，即現(xiàn)在所得突變株突變位點為：I41L、E57D、P97Q。

圖2 第一輪和第二輪篩選獲得的丁醇耐受突變株在體積分?jǐn)?shù)1.2%丁醇下的生長情況Fig.2 Cell growth of high butanol tolerant mutants in1.2%butanol afterthe first and second round screening

2.3 突變株B8對丁醇極限耐受體積分?jǐn)?shù)實驗

為了進一步確定丁醇耐受突變株B8對丁醇的極限耐受體積分?jǐn)?shù)。我們將攜帶有野生型rpoD的對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變株B8分別在體積分?jǐn)?shù)1.2%～2.2%丁醇遞增的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h，測定各體積分?jǐn)?shù)下菌株的OD660值，見圖3。發(fā)現(xiàn)當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)達到2.0%時，B8的OD660達到0.372，隨著丁醇體積分?jǐn)?shù)的增加，B8停止生長，而對照菌株在體積分?jǐn)?shù)1.2%的丁醇中就已經(jīng)停止生長，表明我們篩選到的突變株B8最高能夠耐受體積分?jǐn)?shù)2.0%的丁醇，比對照菌株丁醇耐受性提高了近一倍。同時為了排除溶劑馴化造成的影響，我們提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，并與對照菌株同時在含有體積分?jǐn)?shù)2%丁醇的LB/Cm培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，測定它們的生長曲線，見圖4。結(jié)果表明，B8的生長情況明顯好于對照菌株，排除了丁醇馴化的影響。先前研究報道，Bui等人通過突變?nèi)斯まD(zhuǎn)錄因子ATF結(jié)合過表達細(xì)胞膜相關(guān)基因的方法將大腸桿菌丁醇耐受性提高到體積分?jǐn)?shù)2.0%[18]。這與我們篩選的菌株耐受體積分?jǐn)?shù)相當(dāng)，但是本研究的方法更加簡單、快速，省去了繁雜的菌株構(gòu)建過程。

圖3 突變株B8丁醇耐受體積分?jǐn)?shù)測定Fig.3 Butanol tolerance assay of mutant B8

圖4 對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變株B8在體積分?jǐn)?shù)2%丁醇下的生長情況Fig.4 Growth curve of WT and mutant B8 in 2%butanol

2.4 B8對其他有機溶劑的耐受性

突變株B8對丁醇表現(xiàn)出了較好的耐受性，為了驗證該突變株是否對其他有機溶劑也具有較好的耐受性，我們通過向培養(yǎng)基中添加毒性程度不同的有機溶劑來證明該菌株的溶劑耐受性，結(jié)果見圖5。突變株B8對異丁醇、乙醇、環(huán)己烷、甲苯的最大耐受體積分?jǐn)?shù)分別為3%、8%、4%和0.3%。而對照菌株在體積分?jǐn)?shù)1%的異丁醇、3%乙醇、1%環(huán)己烷和0.15%甲苯中就停止生長，表明我們篩選獲得的突變株不僅能夠耐受丁醇，對其他有機溶劑的耐受性也有明顯的提高，說明該突變株對丁醇耐受機制與對其他溶劑的耐受機制存在共性。先前也有研究表明，大腸桿菌中與丁醇耐受相關(guān)基因?qū)σ掖肌惗〈纪瑯佑休^好的耐受性[19]。這對利用耐受菌株在不同的兩相生物催化體系中的應(yīng)用具有重要意義。

圖5 突變株B8對異丁醇、乙醇、環(huán)己烷、甲苯的耐受性Fig.5 Solvent tolerance of mutant B8 towards isobutanol，ethanol，cyclohexane and toluene

2.5 E.coli JM109/pHACMWT和突變菌株B8胞內(nèi)丁醇體積分?jǐn)?shù)的測定

為進一步探究突變株B8丁醇耐受性提高的原因，我們比較了對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變株B8在體積分?jǐn)?shù)0.8%在丁醇脅迫下胞內(nèi)丁醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。我們發(fā)現(xiàn)，在37℃培養(yǎng)1.5 h后，B8胞內(nèi)丁醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.29 μg/mg，明顯低于對照菌株2.86 μg/mg。由于丁醇能夠透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞，不僅對細(xì)胞膜具有嚴(yán)重的破壞性，而且可以破壞細(xì)胞內(nèi)代謝平衡，對細(xì)胞具有致命的殺傷力[20]。實驗結(jié)果表明，突變株B8對丁醇有更好的抵御能力，這也是突變株對丁醇具有較高耐受性的原因之一。

2.6 E.coli JM109/pHACMWT和突變菌株B8對不同pH耐受的比較

細(xì)胞會產(chǎn)生大量能量來抵御外界有機溶劑的壓力[21]，且通過電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP的同時會產(chǎn)生大量的H+，細(xì)胞會將這些H+排除體外以維持胞內(nèi)代謝平衡，致使細(xì)胞生長環(huán)境的pH會降低。因此我們通過比較對照菌株和突變株B8在不同pH下的生長情況來進一步說明B8丁醇耐受性提高的原因。如圖6所示，除pH 3.5時對照菌株和突變株B8生長完全受到抑制外，在其他pH環(huán)境下B8的生長狀況都明顯好于對照菌株。pH為5時，B8的OD660達到了1.8，表明在酸性條件下突變株B8的生長情況良好。進一步表明B8能夠更好的適應(yīng)在抵御壓力過程中所造成的胞內(nèi)和胞外的變化。

圖6 突變株B8在不同pH下的生長情況Fig.6 Growth of mutant B8 underdifferent pHs

2.7 Mg2+對菌株耐受性的影響

早期研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+能夠提高P.putida對有機溶劑的耐受能力，于是我們測定了Mg2+對大腸桿菌突變株B8的耐受性的影響。結(jié)果見圖7。突變株B8和對照菌株在體積分?jǐn)?shù)0.5%丁醇壓力下，Mg2+的添加均能提高菌株對丁醇的耐受。在培養(yǎng)10 h后，突變株B8的 OD660由不加 M2+條件下的2.45提高至2.81。Mg2+可以與細(xì)胞表面的電負(fù)性的脂多糖LPS螯合，從而減少了細(xì)胞膜組分間的電子斥力，使得細(xì)胞外膜變的更加穩(wěn)定，從而更有效的抵抗外界有機溶劑對細(xì)胞的破環(huán)[22-23]。

圖7 Mg2+對突變株B8和對照菌株耐受性的影響Fig.7 Effect of Mg2+on butanol tolerance of B8 and WTstrains

3 結(jié) 語

大腸桿菌作為一種常用的平臺工程菌株，遺傳背景清楚，分子操作相對簡單，更有利于工業(yè)應(yīng)用。利用全局轉(zhuǎn)錄機制工程來篩選丁醇耐受性菌株作為一種快速有效的方法，為研究細(xì)胞復(fù)雜生理現(xiàn)象奠定了基礎(chǔ)。作者采用隨機突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子σ70的方法篩選獲得了一株能夠耐受體積分?jǐn)?shù)2%丁醇的大腸桿菌突變株B8，并對照菌株E.coli JM109/pHACMWT和突變株B8與丁醇耐受相關(guān)的性質(zhì)進行了研究，初步探討了大腸桿菌丁醇耐受性提高的原因。本研究為有效提高微生物菌株的丁醇耐受性提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。