李秀良， 張俸偉， 曹艷紅， 吳柱月， 黨瑞華， 李紹波， 陳 宏， 雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

南丹牛屬于役肉兼用地方黃牛品種，中心產(chǎn)區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)南丹縣境內(nèi)，以中堡、月里、里湖、八圩4個(gè)鄉(xiāng)、鎮(zhèn)及周邊地區(qū)為主。南丹縣地理位置獨(dú)特，北接貴州省，西邊與云南省比鄰。云貴高原在此地地勢(shì)放緩，由高原向丘陵地帶過渡，海拔800～1 000 m，因此南丹縣氣候條件優(yōu)越，無嚴(yán)寒酷暑。南丹、天峨、環(huán)江等縣自古生活著許多少數(shù)民族(壯、瑤、苗、彝、仫佬等)，這些少數(shù)民族歷來就有養(yǎng)牛的習(xí)慣，并且每逢紅白喜事有殺牛的民族風(fēng)俗。因此，獨(dú)特的自然環(huán)境和社會(huì)條件形成了南丹牛爬坡能力強(qiáng)、適應(yīng)性好、易于飼養(yǎng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的特色[1-2]。

哺乳動(dòng)物Y染色體遵循父系遺傳，突變率很低，較易產(chǎn)生動(dòng)物特異的單倍型，能準(zhǔn)確地反映動(dòng)物進(jìn)化的歷史。Y染色體分子遺傳標(biāo)記是研究父系遺傳多樣性的理想材料，常用的Y染色體標(biāo)記有Y-SNPs(UTY-19、ZFY-10和USP9Y)和Y-STRs(INRA189和BM861)。使用Y-SNPs確定哺乳動(dòng)物Y染色體單倍型組，再根據(jù)Y-STRs進(jìn)行各單倍型組內(nèi)部細(xì)化，結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs區(qū)分Y染色體父系起源更加準(zhǔn)確[3]。Edwards等[4]利用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs(INRA189和BM861)標(biāo)記研究了138個(gè)牛品種的父系遺傳多樣性，結(jié)果表明歐洲家牛屬于普通牛(Y1和Y2)，亞洲西南部分布瘤牛Y3單倍型組。

目前，有關(guān)南丹牛Y染色體遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究未見報(bào)道。因此，本研究采用2對(duì)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和2對(duì)Y-STRs(NRA189和BM861)分析南丹牛的父系起源，以期為南丹牛的種質(zhì)資源保護(hù)和育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

從廣西壯族自治區(qū)南丹縣采集25頭南丹公牛耳組織樣本，用傳統(tǒng)酚氯仿法提取基因組DNA，并將其稀釋到10 ng/μL,保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

選用侯佳雯等[5]報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2個(gè)經(jīng)典的Y-STRs位點(diǎn)，即INRA189和BM861標(biāo)記。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。PCR擴(kuò)增體系為12.5 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 6.25 μL引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1 μL，超純水5.25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 測(cè)序、單倍型組分型及單倍型多樣度分析

檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行正向測(cè)序，使用SeqMan v7.1軟件對(duì)Y-SNPs的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用GeneMarker V1.91軟件對(duì)Y-STRs結(jié)果進(jìn)行查看和校正，并用Arlequin 3.0軟件進(jìn)行單倍型多樣度(H±SD)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)25頭南丹牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)UTY-19標(biāo)記存在C>A顛換，而ZFY-10標(biāo)記存在C>T顛換和1個(gè)GT核苷酸插入/缺失多態(tài)位點(diǎn)。以侯佳雯等[5]報(bào)道的家牛Y染色體單倍型組判定的標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合2個(gè)標(biāo)記的核苷酸變異確定單倍型組，結(jié)果顯示，25頭南丹牛都屬于Y3單倍型組，表明南丹牛全部是瘤牛父系起源。同時(shí)利用2個(gè)家牛Y染色體特異性微衛(wèi)星標(biāo)記INRA189和BM861分析南丹牛Y染色體多態(tài)性，結(jié)果顯示，在INRA189標(biāo)記中檢測(cè)到2個(gè)等位基因，分別是88 bp和90 bp；在BM861標(biāo)記中僅檢測(cè)到1個(gè)等位基因，片段大小為156 bp。結(jié)合Y-SNPs與Y-STR標(biāo)記聯(lián)合分析，在25頭南丹牛中共確定了Y3-88-156和Y3-90-156單倍型(表1)，其中Y3-88-156單倍型占優(yōu)勢(shì)(92%)，Y3-90-156單倍型的概率很低(8%)。南丹牛的Y染色體單倍型多樣度為0.1533±0.0915。

表1 南丹牛Y染色體單倍型組頻率及多樣度

3 討 論

Y染色體分子標(biāo)記是研究家牛父系起源的理想工具，已經(jīng)被應(yīng)用于世界各地家牛品種的父系起源研究中。G?therstr?m等[6]對(duì)180頭歐洲家牛進(jìn)行Y-SNPs分析，結(jié)果表明歐洲家牛是普通牛Y1和Y2起源，其中Y1單倍型組主要分布在北歐，Y2單倍型組集中在南歐。頓珠加才等[7]用2對(duì)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)對(duì)西藏地區(qū)的西藏牛和日喀則駝峰牛的父系遺傳進(jìn)行研究，結(jié)果表明西藏牛包含普通牛Y1、Y2及瘤牛Y3共3種單倍型組；日喀則駝峰牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3共2種單倍型組。本研究表明，南丹牛屬于瘤牛Y3單倍型組。該結(jié)果與雷初朝等[8]提出的中國(guó)南方黃牛受瘤牛的影響較大的論述一致。

Y染色體單倍型多樣度是評(píng)價(jià)群體變異程度的重要指標(biāo)。侯佳雯等[5]利用Y-SNPs標(biāo)記和Y-STRs標(biāo)記對(duì)皖南牛的父系遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明皖南牛的單倍型多樣度是0.218 5。Li等[8]對(duì)中國(guó)16個(gè)黃牛品種302頭牛進(jìn)行研究得出的平均單倍型多樣度為0.683 1。本研究發(fā)現(xiàn)南丹牛的Y染色體單倍型多樣度為0.153 3，低于侯佳雯等[5]對(duì)皖南牛的Y染色體單倍型多樣度(0.218 5)，同樣低于Li等[9]對(duì)中國(guó)16個(gè)地方黃牛品種的平均Y染色體單倍型多樣度(0.683 1)，但明顯高于李芳玉等[10]對(duì)大別山牛的Y染色體單倍型多樣度(0)，表明南丹牛的Y染色體遺傳多樣性較低，這可能與南丹牛的繁殖方式落后有關(guān)[11]，也說明南丹牛Y染色體遺傳性能穩(wěn)定，種質(zhì)資源保存完好。

南丹牛產(chǎn)于溫濕山地，經(jīng)當(dāng)?shù)厝嗣耖L(zhǎng)期選育和風(fēng)土馴化，具有耐粗飼、耐熱、耐寒和遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[1]。目前，由于農(nóng)村機(jī)械化程度提高，導(dǎo)致優(yōu)良南丹牛大量作為肉牛飼養(yǎng)與屠宰，使得南丹牛的整體質(zhì)量下降，個(gè)體變小[1,11]。所以應(yīng)對(duì)南丹牛進(jìn)行全面保種和本品種選育提高，實(shí)行異地交換種公牛，防止近親交配，逐步提高南丹牛的生產(chǎn)性能。