(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106； 2.成都列五中學(xué)， 四川 成都 610007)

卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)屬于百合科多年生草本植物，生長在海拔2 800～4 700 m的高山灌叢或草地中[1]，喜在冷涼氣候條件下生長，具有耐寒、喜濕、怕高溫、喜蔭蔽的特性。卷葉貝母具有清熱潤肺，化痰止咳之功效，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀，以卷葉貝母為原料的中成藥達(dá)100種以上[2]，卷葉貝母是稀有的治療咳嗽的良藥。近年來，由于卷葉貝母價格昂貴，加之無計劃的盲目采挖，自然資源已日趨枯竭，其價格也不斷上漲。

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物上的廣泛應(yīng)用，其已成為保護(hù)瀕臨滅絕的野生藥用資源和生產(chǎn)替代品的關(guān)鍵手段[3]。組織培養(yǎng)技術(shù)生長周期短，繁殖率高，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。卷葉貝母植物的入藥部位是其鱗莖，筆者按照2015年藥典方法測定了野生卷葉貝母植株的鱗莖和根器官中的總生物堿含量，發(fā)現(xiàn)鱗莖中的總生物堿含量為0.068%，而根中的總生物堿含量為0.071%，比鱗莖稍高。因此本實驗采用卷葉貝母的根進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)研究，以期獲得生長快、有效成分含量高的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，為進(jìn)一步開展卷葉貝母大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分提供良好的材料，從而很好地緩解卷葉貝母藥材資源短缺問題，同時也可為卷葉貝母的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗材料來自四川省阿壩自治州的野生卷葉貝母植株根，經(jīng)成都大學(xué)中藥鑒定室鑒定為卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)。

1.2 方 法

1.2.1外植體不同消毒時間的篩選

選取生長2年以上、生長狀況良好的卷葉貝母植株根，先用濃度為0.03%的升汞液將根表面沖洗干凈后，放在18 ℃的條件下陰干4 h，再放在超凈臺上，采用在每100 mL的0.1%升汞溶液中滴加0.7 mL濃度為0.4%聚乙二醇辛基苯基醚溶液進(jìn)行消毒處理，并用無菌水洗5次，最后用無菌濾紙吸干材料表面的水分，在超凈臺上進(jìn)行消毒的時間分別為1，3，5，7，9 min，編號為A 1～A 5。

將消毒后的根，接種于MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂5.5 g·L-1，pH值為6.0，在溫度15 ℃，每天光照6 h和光照強(qiáng)度為1 800 lx的條件下培養(yǎng)(下同)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織的染菌率和啟動率。

1.2.2不同激素配比對根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

切取已消毒的卷葉貝母根尖1.5 cm，接入改良的MS基本培養(yǎng)基(無機(jī)物硝酸氨的含量減半)中，并且添加細(xì)胞分裂素異戊烯基腺嘌呤(2 iP)的濃度范圍設(shè)定為0.5～1.5 mg·L-1，生長素萘乙酸(NAA)的濃度范圍設(shè)定為0.3～1.0 mg·L-1，共配制12種培養(yǎng)基，編號分別為B 1～B 12，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

1.2.3不同激素配比對根愈傷組織增殖的影響

選取培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成0.6 cm3團(tuán)塊大小轉(zhuǎn)接入B 5+多效唑1.0 mg·L-1+活性炭1.5 mg·L-1的基本培養(yǎng)基中，再附加生長素2,4-D 的濃度范圍為1.0～4.0 mg·L-1，細(xì)胞分裂素KT 0.1～1.0 mg·L-1，共配制10種培養(yǎng)基，編號分別為C 0～C 9，在溫度18 ℃，每天光照3 h和光照強(qiáng)度為400 lx的條件下增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織的增殖情況。

1.2.4實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

染菌率(%)=(染菌外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

啟動率(%)=(啟動的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

愈傷組織增殖倍數(shù)=收獲的重量/接種的重量。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體不同消毒時間的研究

在組織培養(yǎng)過程中，對外植體進(jìn)行有效的消毒處理是非常重要的。本實驗針對卷葉貝母植株根生長在土壤中的狀況，選擇先采用濃度為0.03%的升汞液沖洗根表面后，再在超凈臺上采用改良的升汞液進(jìn)行不同時間的消毒處理，其實驗結(jié)果見表1。

表1 不同消毒時間對卷葉貝母根外植體的消毒影響

編號消毒時間/min染菌率/%啟動率/%A1132.5371.51A2310.5680.55A35082.35A47065.56A59037.50

注：接種30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以根體積產(chǎn)生膨大計為啟動的外植體。

從表1可以看出，采取不同的消毒時間對卷葉貝母根外植體的染菌率和啟動率都有顯著影響。從觀察根外植體的染菌狀況來看，隨著A 1到A 5消毒時間的逐漸遞增，外植體的染菌率表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，其中在A 3至A 5的消毒時間段，根外植體都沒有出現(xiàn)染菌，接種30 d后統(tǒng)計的染菌率都為0%；而從卷葉貝母根外植體的啟動狀況來看，隨消毒時間由A 1到A 5的逐漸遞增，根外植體的啟動率呈先上升后下降的趨勢，其中在A 3的消毒時間內(nèi)，根外植體的啟動率最高達(dá)到82.35%，而在A 5的消毒時間根外植體的啟動率最低，僅為37.50%，并且通過觀察實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消毒時間達(dá)到5 min時，根外植體呈現(xiàn)出明顯的升汞中毒現(xiàn)象，外植體質(zhì)地變得松軟，生長也停滯。這是因為升汞HgCl2為重金屬鹽類，其作用機(jī)制是HgCl2與微生物蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合而使微生物失活，但同時對植物也會造成傷害[4]。因此，從降低卷葉川貝根外植體的染菌率和提高其啟動率兩方面來綜合考慮，應(yīng)選取A 3即5 min的消毒時間，在此條件下外植體的污染率為0%，而啟動率為82.35%。

2.2 不同激素配比對根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取表1中的A 3即5 min消毒時間對卷葉貝母根進(jìn)行消毒處理后，接種在含有不同濃度異戊烯基腺嘌呤(2 iP)和NAA的組合的12種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計實驗結(jié)果(見表2)。

表2 不同激素配比對根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

編號激素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)2iPNAA誘導(dǎo)率/%B10.5030.45B20.50.343.56B30.50.653.72B40.51.060.27B51.0068.56B61.00.372.30B71.00.685.41B81.01.080.31B91.50 60.23B101.50.371.36B111.50.677.49B121.51.053.49

由表2可以看出，由不同濃度的2 iP和NAA組合的培養(yǎng)基配方，對卷葉貝母根外植體的愈傷組織誘導(dǎo)影響較大。當(dāng)2 iP濃度為0.5 mg·L-1不變時，B 1～B 4隨著NAA濃度逐漸升高，誘導(dǎo)率逐漸增加，其中B 4時誘導(dǎo)率達(dá)到60.27%；而當(dāng)2 iP濃度為1.0 mg·L-1不變時，B 5～B 8隨著NAA濃度逐漸升高，其愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，其中以B 7的誘導(dǎo)率為最高，為85.41%；當(dāng)2 iP濃度為1.5 mg·L-1不變時，B 9～B 12隨著NAA濃度逐漸升高，其愈傷組織誘導(dǎo)率也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中以B 12的愈傷組織誘導(dǎo)率低，為53.49%，這說明盡管NAA具有促進(jìn)卷葉貝母根外植體產(chǎn)生愈傷組織的作用，但是高濃度的NAA還是有其抑制作用，這一結(jié)果與付文奇等[5]、康微等[6]的研究結(jié)果相同。

當(dāng)NAA濃度為0.3 mg·L-1時，B 1、B 5、B 9隨著2 iP濃度逐漸升高，誘導(dǎo)率呈先增后減的趨勢，這一結(jié)果表明，低濃度的2 iP能促進(jìn)卷葉貝母根愈傷組織的誘導(dǎo)，而高濃度則抑制愈傷組織的誘導(dǎo)。使用的激素種類、濃度及培養(yǎng)條件對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)有很重要作用，實質(zhì)是培養(yǎng)基中的外源激素被植物吸入植物體內(nèi)，再和內(nèi)源激素共同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織[7]。綜合分析表2可以看出，B 7培養(yǎng)基MS+2 iP 1.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1是誘導(dǎo)卷葉貝母根愈傷組織產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基配方；觀察發(fā)現(xiàn)，卷葉貝母根外植體在培養(yǎng)7 d時，在根基部的切口處出現(xiàn)了明顯的膨大，在培養(yǎng)15 d后開始有呈白色較緊密的愈傷組織產(chǎn)生，在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計其愈傷組織的誘導(dǎo)率為85.41%。

2.3 不同激素配比對根愈傷組織增殖的影響

選擇由2.2 誘導(dǎo)獲得的質(zhì)地較緊密、顏色為白色的愈傷組織，切成0.6 cm3團(tuán)塊大小轉(zhuǎn)接入表3的10種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計根愈傷組織的增殖倍數(shù)，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同激素配比對根愈傷組織增殖的影響

編號激素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)KT2,4-D增殖倍數(shù)/倍C00.00.01.87C10.11.02.09C20.13.02.59C30.15.01.96C40.31.02.79C50.33.03.26C60.35.03.01C70.51.02.65C80.53.02.84C90.55.02.57

由表3可知，將根愈傷組織接入未加激素的C 0培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)30 d后的愈傷組織增殖倍數(shù)僅為1.87倍，是上述10種培養(yǎng)基中最低的。說明植物激素對卷葉貝母根愈傷組織的增殖生長有重要的促進(jìn)作用。當(dāng)KT濃度為0.1，0.3，0.5 mg·L-1保持不變時，隨著2,4-D濃度逐漸升高，C 1～C 3，C 4～C 6，C 7～C 9均呈現(xiàn)出由低升高再降低的趨勢，說明2,4-D在低濃度對愈傷組織增殖有促進(jìn)作用而高濃度抑制其生長，與涂紅艷等[8]的研究結(jié)果一致；隨著2,4-D濃度的增加，培養(yǎng)的愈傷組織褐化情況加重，這是由于高濃度的2,4-D對愈傷組織有一定的毒效應(yīng)。

當(dāng)2,4-D為3.0 mg·L-1保持不變時，隨著KT濃度逐漸升高，C 2、C 5和C 8增值倍數(shù)分別呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，說明低濃度KT對愈傷組織增殖有一定促進(jìn)作用，而高濃度KT反而抑制愈傷組織生長；同時在C 7～C 9中，褐化程度明顯減小，說明高濃度的KT有明顯減輕褐化作用[9]；上述不同濃度激素的培養(yǎng)基中均能形成愈傷組織，其中倍數(shù)最大的方案為附加KT 0.5 mg·L-1和2,4-D 3.0 mg·L-1，此時增殖倍數(shù)為3.26倍。綜合考慮愈傷組織增殖倍數(shù)及生長情況可以得出，C 8培養(yǎng)基MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1最適于卷葉貝母愈傷組織的增殖，產(chǎn)生生長健康、無褐化和玻璃化現(xiàn)象的愈傷組織。

3 結(jié) 論

本實驗利用卷葉貝母根為外植體，經(jīng)適宜的消毒和誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)后，成功地誘導(dǎo)出愈傷組織，成功地實現(xiàn)了卷葉貝母愈傷組織的快速增殖培養(yǎng)，本研究對利用生物技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)母藥物有效成分奠定了堅實基礎(chǔ)。從消毒時間篩選、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選、增殖培養(yǎng)基篩選等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，外源生長調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞生長素和細(xì)胞分裂素，是誘導(dǎo)外植體脫分化的重要因素[10]。細(xì)胞生長素能影響細(xì)胞分裂、伸長和分化，有利于外植體脫分化形成愈傷組織，而細(xì)胞分裂素能降低愈傷組織的誘導(dǎo)率，抑制愈傷組織的生長。試驗結(jié)果表明，選擇外源激素的種類、濃度及不同的激素組合對外植體細(xì)胞誘導(dǎo)以及增殖發(fā)生具有顯著影響，這是因為激素是植物體內(nèi)的微量信號分子，其濃度以及不同組織對激素的敏感性控制了植物的整個發(fā)育進(jìn)程。

本實驗主要選取2年生以上的卷葉貝母根為外植體，實現(xiàn)了其愈傷組織誘導(dǎo)與增殖；另外，嘗試選用1年生的卷葉貝母根進(jìn)行實驗，但在長時間的培養(yǎng)過程中很少有外植體啟動和愈傷組織產(chǎn)生的情況，這說明選擇處于不同生長時期的外植體材料對其愈傷組織的誘導(dǎo)也有十分重要的影響；在對外植體進(jìn)行消毒處理時，相同條件下若將根切開接入培養(yǎng)基，染菌率會大大增加，而啟動率無明顯提高，所以外植體的處理對愈傷組織誘導(dǎo)有著一定影響；同時，將根以平放方式放在培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于豎直方式插入培養(yǎng)基，這說明選擇接種方式對愈傷組織誘導(dǎo)有著重要作用；另外，在進(jìn)行愈傷組織卷葉貝母增殖培養(yǎng)時，選擇進(jìn)行增殖的愈傷組織不能切割太小，但是創(chuàng)傷面要盡量小，這樣更有利于愈傷組織的快速增殖。