紅水櫻桃種子玻璃化超低溫保存

(1.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院， 貴陽 550003； 2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025；3.貴陽市農(nóng)業(yè)試驗(yàn)中心， 貴州 貴陽 550003)

紅水櫻桃(PrunuspseudocerasuL.‘Hongshui’)是貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣主栽中國櫻桃品種之一，在當(dāng)?shù)鼐哂泻軓?qiáng)的適應(yīng)性，市場銷量大，具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。有關(guān)紅水櫻桃的研究較少，尤其是種質(zhì)資源長期保存方面，至今未見報道。

常見的種質(zhì)資源保存為離體保存，常規(guī)的離體保存有體細(xì)胞無性系變異情況，而超低溫保存是將材料儲存在液氮中保存數(shù)百年甚至更長時間[1]，是目前唯一可行的長期保存方式[2]，至今已有許多關(guān)于種子超低溫保存的報道。藍(lán)藥花[1]、黑楊[3]、玉簪[4]和中國紅豆杉[5]等均已獲得成功。櫻桃種子超低溫保存方面，Chmielarz等[6]對歐洲野櫻桃進(jìn)行了超低溫保存，而中國櫻桃在此方面卻未見報道。眾所周知，同一植物品種不同離體保存條件亦有差異，因此，考慮紅水櫻桃市場價值較大和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，對其種子進(jìn)行超低溫保存實(shí)驗(yàn)，以期為育種、砧木繁殖等提供物質(zhì)保障，同時對中國櫻桃種質(zhì)資源長期保存提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

紅水櫻桃種子于2015年4月下旬采自貴州安順鎮(zhèn)寧縣，去果肉晾干后置于4 ℃冰箱保存4個月備用。

1.2 方 法

1.2.1種子含水量測定

絕對含水量(T1)：將100 g種子置于105 ℃恒溫干燥箱中快速干燥至恒重W；相對含水量(T2)：將一定重量種子(W1)置于30 ℃恒溫干燥箱中干燥至一定重量(W2)。

T1=(100-W)/100；

T2=[W2-W1·(1-T1)]/W2。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分別探討了種子不同含水量[25%、30%、35%及45%(T1)]、不同裝載時間[0、20、40及60 min]、不同玻璃化時間[0、30、60及90 min]及去留種殼對超低溫保存的影響(表1)。

含水量實(shí)驗(yàn)：將帶種殼種子于4 ℃經(jīng)60%PVS2(PVS2: 0.15 mol/L蔗糖=60∶40)裝載20 min，然后室溫下經(jīng)PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4 mol/L蔗糖)玻璃化60 min，更換PVS2后立即投入液氮。

裝載時間實(shí)驗(yàn)：將含水量30%的帶種殼種子于4 ℃經(jīng)60%PVS2處理相應(yīng)時間，然后室溫下經(jīng)PVS2玻璃化60 min，更換PVS2后立即投入液氮。

玻璃化時間實(shí)驗(yàn)：將含水量30%的帶種殼種子于4 ℃經(jīng)60%PVS2裝載20 min，然后室溫下經(jīng)PVS2處理相應(yīng)時間，更換PVS2后立即投入液氮。裝載和玻璃化處理時設(shè)置2個對照，探討冰凍保護(hù)劑對種子的影響，即ck1：含水量為30%的種子不經(jīng)處理直接投入液氮；ck2：含水量為30%的種子不經(jīng)處理，但加PVS2后投入液氮。

表1 4種因素對紅水櫻桃種子超低溫保存的影響

處理 發(fā)芽率/% 污染率/% 生長勢 含水量/%4575.00±5.77c9.21±10.64bc上胚軸短,葉略卷,綠至濃綠色3580.00±8.16bc19.55±14.37b上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色30100.00±0a0±0c上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色2590.00±14.14ab36.00±7.92a上胚軸較長,葉較窄,濃綠色裝載時間/min090.00±0ab35.00±10.00ab上胚軸短無,葉卷,濃綠色20100.00±0a0±0b上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色40100.00±0a10.00±14.14b上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色6080.00±8.16b30.00±8.16ab上胚軸短,葉略卷,濃綠色ck190.00±8.16ab30.00±18.26ab上胚軸短,葉略卷,濃綠色ck275.00±10.00b45.00±10.00a上胚軸極短,葉卷,濃綠色玻璃化時間/min090.00±8.16ab30.00±14.14ab上胚軸較長,葉較窄,濃綠色30100.00±0a15.00±5.77b上胚軸長,葉窄而舒展,濃綠色60100.00±0a0±0b上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色90100.00±0a20.00±8.16b上胚軸較長,葉窄而舒展,濃綠色ck190.00±8.16ab30.00±18.26ab上胚軸短,葉略卷,濃綠色ck275.00±10.00b45.00±10.00a上胚軸極短,葉卷,濃綠色種殼去留有100.000上胚軸長,葉大而舒展,濃綠色無15.0087.50多數(shù)不萌發(fā),污染重,苗畸形色淡

注：同列內(nèi)相同字母表示經(jīng)鄧肯氏多重極差檢驗(yàn)在0.05水平上差異不顯著。

去留種殼實(shí)驗(yàn)：將含水量30%的種子分去掉種殼和保留種殼處理，均在4 ℃經(jīng)60%PVS2裝載20 min，然后室溫下經(jīng)PVS2玻璃化60 min，更換PVS2后立即投入液氮。每處理為40粒種子，每10粒為一個重復(fù)，重復(fù)4次。

1.2.3發(fā)芽率檢測

所有處理經(jīng)液氮保存1 d后用43 ℃水浴解凍3 min，去種殼后經(jīng)無菌水浸泡2 h，在超凈工作臺上用70%酒精浸泡30 s，用0.1%升汞+數(shù)滴吐溫80滅菌10 min，再用無菌水清洗5次后去種皮接種在1/2 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+2.0 mg·L-1GA+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂粉培養(yǎng)基上誘導(dǎo)萌發(fā)。溫度(25±2)℃，光強(qiáng)33μmol·(m2·s)-1，光周期14 h/d，20 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和污染率，發(fā)芽率=(發(fā)芽數(shù)/原接種數(shù))×100%，污染率=(污染數(shù)/原接種數(shù))×100%，除種殼處理外數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子含水量的影響

櫻桃種子含水量對其超低溫保存有顯著影響(表1)。本試驗(yàn)中，含水量25%的發(fā)芽率為90%，葉面較窄，污染率為36%；含水量30%的種子發(fā)芽率達(dá)100%，無污染，且出芽后上胚軸長，葉大而舒展；含水量為35%的種子雖然發(fā)芽率僅80%，但生長勢較好，污染率為19%；含水量45%的種子不僅發(fā)芽率最低(75%)，且上胚軸短，葉略卷，色稍淡。因此，以含水量30%的種子進(jìn)行超低溫保存較好。

2.2 裝載時間的影響

種子裝載時間對其超低溫保存后的發(fā)芽率有一定影響(表1)。裝載20 min和40 min時發(fā)芽率均為100%，且上胚軸長，葉大而舒展；裝載0 min時為90%，但上胚軸短或無，葉卷曲；裝載60 min時僅80%，且上胚軸短，葉略卷。不經(jīng)任何處理直接投入保存的ck1，發(fā)芽率雖然也達(dá)90%，但上胚軸短，葉略卷，形態(tài)較差；不經(jīng)處理但加PVS2后再保存的ck2，發(fā)芽率僅為75%，上胚軸也極短，葉卷，畸形較重。因此，預(yù)處理時間以20～40 min為好。

2.3 玻璃化時間的影響

雖然PVS2玻璃化時間的長短對種子超低溫保存成活率影響不大，但對生長勢有較大影響(表1)。經(jīng)PVS2處理30～90 min的種子，發(fā)芽率沒有區(qū)別，均為100%，但其生長勢以60 min時為好，上胚軸長，葉大而舒展，其余兩者葉片較窄；處理0 min時發(fā)芽率略低(90%)，上胚軸稍短，葉較窄。ck1和ck2表現(xiàn)同2.2。因此，種子超低溫保存時用PVS2處理60 min為好。

2.4 種殼的影響

種殼對種子超低溫保存有顯著影響(表1)。帶種殼發(fā)芽率達(dá)100%，且無污染，上胚軸長，葉大而舒展，色濃綠；而無種殼發(fā)芽率僅15%，且苗畸形，污染率高達(dá)87.5%。因此，櫻桃超低溫保存時保留種殼為好。

3 討 論

3.1 含水量和種殼

種子超低溫保存的關(guān)鍵因素是確定最適含水量[6]，不同植物適宜含水量范圍不一樣。垂枝樺超低溫保存的最佳含水量為2%～23%[7]。歐洲野櫻桃種子剝除種殼后，最佳含水量為9%～16.9%[6]。而本試驗(yàn)帶種殼的紅水櫻桃種子最佳含水量為30%。2種櫻桃種子含水量差別較大，分析原因有2個，第一，含水量計(jì)算時有帶種殼和不帶種殼的區(qū)別，差別有多大還有待進(jìn)一步探討；第二，含水量并非櫻桃種子超低溫保存的關(guān)鍵因素。歐洲甜櫻桃種子含大量以甘油三酯形式存在的脂類物質(zhì)[8]，此類種子能忍受低溫[9]，因此，含水量并非甜櫻桃種子超低溫保存的關(guān)鍵條件[6]。本試驗(yàn)亦認(rèn)為含水量并非貴州櫻桃種子超低溫保存的關(guān)鍵因素，其關(guān)鍵因素是種殼保留與否。本試驗(yàn)中不帶種殼進(jìn)行超低溫保存，幾乎不萌發(fā)，污染率極高，究其原因可能是經(jīng)過低溫與室溫之間的變化刺激，種皮易破裂污染所致。合歡種子超低溫保存時，含水量為5.76%～10.03%時萌發(fā)力沒有明顯差異，但炸裂率明顯提高[10]。種子存入液氮后炸裂，認(rèn)為是在冷凍和解凍過程中種子要經(jīng)受極大的物理壓力，如果種子的細(xì)胞間質(zhì)承受不了如此巨大的壓力，就會產(chǎn)生物理損傷，種皮破裂，這承受力跟種子含水量有關(guān)系[11-12]。而試驗(yàn)認(rèn)為種殼能極大地提高這種承受力，帶種殼的櫻桃種子少見種皮破裂現(xiàn)象，且存活率高，生長勢良好，可能因種殼厚實(shí)，能減緩溫度變化對種皮的直接傷害而起保護(hù)作用。在種殼的保護(hù)下，水分影響略顯輕微。

3.2 裝載和玻璃化

雖然試驗(yàn)中裝載和玻璃化時間變化未造成種子發(fā)芽率的急劇下降，但各處理生長勢有較大區(qū)別，處理時間過短或過長都易造成上胚軸短和葉片狹窄卷曲。玻璃化冰凍保護(hù)劑可減少自由基變化，從而避免細(xì)胞損傷[13-15]，但大多數(shù)玻璃化液對材料有毒害作用。因此，玻璃化處理前，通常增加一個裝載過程，即用含少量玻璃化液的溶液對材料進(jìn)行預(yù)處理，不僅能降低材料含水量，同時能讓材料逐漸適應(yīng)玻璃化溶液的毒性，降低損傷。ck1和ck2相比，ck2發(fā)芽率和生長勢都較差，說明未經(jīng)裝載和玻璃化處理，直接使用玻璃化溶液對材料損傷更大。此外，裝載20 min后玻璃化處理0 min時，生長勢比裝載0 min后玻璃化處理60 min時的生長勢好，胚軸相對較長，葉片也無卷曲，說明裝載過程對種子超低溫保存十分重要，這是植物適宜玻璃化液毒性的一個過程，從而降低玻璃化液的損傷。