蔣文霞 牟君

近年來,隨著人口老齡化進(jìn)程的加快,腦卒中的發(fā)病率也隨之升高。據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),僅2015年全球腦卒中患者已達(dá)4240萬[1]。腦卒中的并發(fā)癥主要包括運(yùn)動(dòng)障礙、感覺障礙、認(rèn)知障礙、卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)及自主神經(jīng)功能紊亂等。其中,腦卒中患者PSD的發(fā)病率為28.5%～85.0%[2-4]。PSD以情緒低落和興趣下降為核心臨床表現(xiàn),不但影響患者神經(jīng)功能缺損癥狀的恢復(fù),降低康復(fù)治療效果,還可通過影響患者認(rèn)知功能而顯著降低生活質(zhì)量。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,缺乏預(yù)測(cè)發(fā)病和判定預(yù)后的客觀生物學(xué)指標(biāo)。建立標(biāo)準(zhǔn)化的PSD動(dòng)物模型對(duì)于發(fā)病機(jī)制及治療的研究尤為重要?，F(xiàn)就目前PSD動(dòng)物模型的建模流程及常用方法進(jìn)行總結(jié)。

1 動(dòng)物選擇

PSD動(dòng)物模型常選用大鼠及小鼠,大鼠種類包括SD大鼠[5-12]及Wistar大鼠[13-15],小鼠種類包含 C57BL/6 小 鼠[16-19]、balb/c 小 鼠[20-22]、Laca strai小鼠[23-24]、CD-1小鼠[25]、ICR小鼠[26]。目前各實(shí)驗(yàn)室采用最多的動(dòng)物為SD大鼠,其次為C57BL/6小鼠,CD-1小鼠及ICR小鼠的使用相對(duì)較少。動(dòng)物的選擇以雄性為主,周齡及體重則根據(jù)動(dòng)物種類不同而各異。通過檢索文獻(xiàn),將目前常用動(dòng)物的種類、性別、周齡及體重范圍進(jìn)行匯總,結(jié)果見表1。

表1 常用PSD造模動(dòng)物種類、性別、周齡及體重

2 預(yù)適應(yīng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)適應(yīng)。各實(shí)驗(yàn)室均采用12 h/12 h晝夜周期節(jié)律及自由飲食飲水,但在預(yù)適應(yīng)溫度、濕度、每籠飼養(yǎng)動(dòng)物數(shù)量及適應(yīng)時(shí)間上各有不同。最常用的溫度范圍為19～23℃,濕度范圍為55%～65%,飼養(yǎng)條件為2只/籠。預(yù)適應(yīng)時(shí)間以7 d或14 d最常見。

3 卒中模型制備方法

3.1 大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)p MCAO是目前采用最多的卒中動(dòng)物模型。因?yàn)椴挥冒纬鼍€栓,故最能模擬人類缺血性卒中的發(fā)病過程,成功率高,死亡率低。

3.2 大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(ischemic reperfusion of cerebral middle artery)缺血再灌注模型對(duì)小鼠適用,因需拔除栓塞,實(shí)驗(yàn)操作難度相對(duì)較大,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者要求較高。

3.3 大腦中動(dòng)脈開顱電凝法開顱電凝法可造成模型動(dòng)物皮層缺血,其缺血部位、大小恒定,模型大鼠偏癱程度輕,但開顱手術(shù)會(huì)破壞血-腦屏障,引起腦脊液漏及腦組織損傷,感染幾率增加,手術(shù)難度較大。

3.4 大腦中動(dòng)脈自體血栓塞法自體血栓塞法無需插入或拔除線栓,可更好地模擬自體血栓所致大腦中動(dòng)脈栓塞過程,但栓子栓塞的部位、大小不固定。

3.5 雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久閉塞法(permanent bilateral common carotid artery occlusion,pBCCAO)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法操作簡(jiǎn)單,建模成功率較高,但動(dòng)物術(shù)后癱瘓較重,不利于藥物療效觀察及機(jī)制研究。

3.6 雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注法(ischemic reperfusion of bilateral common carotid artery)相對(duì)于大腦中動(dòng)脈缺血再灌注法,雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注操作簡(jiǎn)單,動(dòng)物損傷小,死亡率低,模型成功率高,缺血和再灌注時(shí)間易于控制,能很好模擬腦梗死再灌注時(shí)腦組織病理生理演變,但模型欠穩(wěn)定。

3.7 局部皮質(zhì)光栓塞法利用感光物質(zhì)可在光照下使局部血管內(nèi)皮損傷及血小板聚集的原理,可根據(jù)需要建立特定皮質(zhì)區(qū)域的栓塞,栓塞部位相對(duì)固定,無需開顱,操作簡(jiǎn)單,避免了手術(shù)對(duì)動(dòng)物腦組織及血管的機(jī)械損傷,對(duì)動(dòng)物全身影響較小,有較高的可重復(fù)性和較低的死亡率。但該模型的栓塞多發(fā)生于終末動(dòng)脈,近似于人類的微血管病變,不能用于解釋人類大腦中動(dòng)脈栓塞的發(fā)病機(jī)制。

目前各卒中模型以p MCAO模型為主,其次為大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型,而開顱電凝法、自體血栓塞及光栓塞法應(yīng)用相對(duì)較少。

4 PSD模型建立方法

大多數(shù)PSD模型是在卒中模型的基礎(chǔ)上經(jīng)過孤養(yǎng)、慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)建立而成。目前各實(shí)驗(yàn)室采用的CUMS模式有14種之多,不同實(shí)驗(yàn)室選用的應(yīng)激組合方案不同?，F(xiàn)通過檢索文獻(xiàn)對(duì)采用的CUMS模式及其使用情況進(jìn)行總結(jié),結(jié)果見圖1。

5 行為學(xué)評(píng)價(jià)

5.1 卒中行為學(xué)評(píng)價(jià)

5.1.1 神經(jīng)功能評(píng)分(m NSS):m NSS評(píng)分為0～18分,0分為正常,最高評(píng)分18分。m NSS通過運(yùn)動(dòng)、感覺及反射來評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度,分?jǐn)?shù)越高則提示動(dòng)物神經(jīng)功能損傷越重。m NSS評(píng)價(jià)相對(duì)全面,但方法較復(fù)雜,操作難度大。

5.1.2 The foot-fault test:該法通過記錄大鼠前爪足誤的次數(shù)來評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能損傷,較為常用,操作簡(jiǎn)單,易執(zhí)行。運(yùn)用該法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)時(shí),雙側(cè)的錯(cuò)誤步數(shù)均需記錄,統(tǒng)計(jì)雙側(cè)錯(cuò)誤步數(shù)的差值,以消除不同大鼠活動(dòng)程度的影響。

5.1.3 Modified grip-traction test:該法通過記錄動(dòng)物從繩子上掉下來的時(shí)間和將損傷側(cè)后肢拉上繩子的能力,客觀評(píng)價(jià)前爪抓握能力和肌力。是目前唯一用于測(cè)量動(dòng)物卒中后肌力的方法,但尚缺乏具體的量化指標(biāo),使用較少,其評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性及有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

5.1.4 Inclined beam-walking test:測(cè)試動(dòng)物通過斜木棒的能力,以評(píng)價(jià)其前后肢的協(xié)調(diào)性,用于有運(yùn)動(dòng)缺損的動(dòng)物模型,若為皮層局部損傷而缺乏運(yùn)動(dòng)障礙的模型則不適用于該法。

5.1.5 Longa評(píng)分:記錄卒中后動(dòng)物行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾斜的情況,是目前各卒中模型使用最多的一項(xiàng)評(píng)分方法,簡(jiǎn)單易行,能較快挑選出符合實(shí)驗(yàn)要求的動(dòng)物。但該測(cè)試方法較主觀,評(píng)估的精確度有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖1 各種CUMS刺激模式及文獻(xiàn)使用情況匯總

5.1.6 Bederson評(píng)分:通過提尾及側(cè)推觀察卒中動(dòng)物前肢屈曲情況,利用動(dòng)物的姿勢(shì)反射在懸尾狀態(tài)下,檢查動(dòng)物上半身姿勢(shì)。在國(guó)內(nèi)外各文獻(xiàn)中應(yīng)用頻率較高,具有較好的可操作性和穩(wěn)定性,但缺乏感覺功能評(píng)定。

5.2 抑郁行為學(xué)評(píng)價(jià)

5.2.1 糖水偏好試驗(yàn)(sucrose preference test,SPT):SPT是目前較經(jīng)典的抑郁行為評(píng)價(jià)方法,利用大鼠對(duì)蔗糖水的嗜好,模擬人類的興趣感。若PSD大鼠的蔗糖水飲用量下降則可模擬PSD患者以興趣感下降為核心的抑郁癥狀。

5.2.2 曠野試驗(yàn)(open field test,OFT):OFT主要用于評(píng)估動(dòng)物的探索性及焦慮行為。動(dòng)物對(duì)新開闊環(huán)境的恐懼主要在周邊區(qū)域活動(dòng),在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少,但動(dòng)物的探究特性又促使其在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的動(dòng)機(jī),若動(dòng)物在曠野中心持續(xù)時(shí)間減少,提示動(dòng)物興趣感下降。

5.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swim test,FST):FST利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無法逃出困境的絕望產(chǎn)生抑郁,但有部分研究者認(rèn)為,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在FST中的靜止?fàn)顟B(tài)可能只是一種適應(yīng)或疲勞現(xiàn)象,而不是真正的絕望行為,因此該評(píng)價(jià)方法有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

5.2.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze test):水迷宮實(shí)驗(yàn)廣泛用于評(píng)價(jià)老鼠的認(rèn)知功能,認(rèn)知功能主要與海馬相關(guān),而大多數(shù)PSD模型是在卒中模型的基礎(chǔ)上建立而成,損傷的主要結(jié)構(gòu)是大腦皮層,故其評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性尚存在一定爭(zhēng)議。

5.2.5 Passive avoidance test:該測(cè)試通過記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由明室進(jìn)入暗室的時(shí)間來評(píng)估動(dòng)物的認(rèn)知功能,其缺陷與水迷宮實(shí)驗(yàn)相同,損傷的結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的學(xué)習(xí)區(qū)不存在直接聯(lián)系,評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性存在爭(zhēng)議。

5.2.6 懸尾試驗(yàn)(tail suspension test,TST):TST通過記錄老鼠懸尾狀態(tài)下的靜止時(shí)間來判斷其抑郁情況,與FST相似,均利用老鼠無法逃脫困境產(chǎn)生抑郁,但TST的靜止不動(dòng)是一種適應(yīng)還是絕望有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,PSD的建模流程包括動(dòng)物選擇、預(yù)適應(yīng)、卒中模型制備、卒中后抑郁模型建立及行為學(xué)評(píng)價(jià)5個(gè)步驟。由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自身選擇及條件不同而使PSD造模各步驟存在一定差異,尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前較為常用的建模方式是在卒中的基礎(chǔ)上聯(lián)合CUMS模擬動(dòng)物PSD狀態(tài),但不同的實(shí)驗(yàn)室選用的卒中模型、CUMS刺激模式及行為學(xué)評(píng)價(jià)方案不盡相同。卒中模型各自存在其優(yōu)缺點(diǎn):MCAO模型較經(jīng)典,能很好地模擬臨床卒中,但大鼠血管細(xì)而軟,死亡率高,對(duì)操作者的要求較高,且易損傷血管周圍迷走神經(jīng)[5]。BCCAO是另一種較常用的卒中模型,術(shù)后更易導(dǎo)致老鼠產(chǎn)生抑郁行為[23],但術(shù)后動(dòng)物的感覺及運(yùn)動(dòng)損傷較重,可能對(duì)抑郁行為評(píng)價(jià)會(huì)產(chǎn)生一定影響。開顱電凝法及光栓塞法,導(dǎo)致的皮層損害較恒定,但開顱電凝法操作難度大,對(duì)動(dòng)物腦部的損傷較大。一個(gè)好的動(dòng)物模型,除需具備與人類疾病的相似性外,還必須具有可靠性、適用性、可控性、可重復(fù)性、易行性及經(jīng)濟(jì)性[27]。標(biāo)準(zhǔn)化的PSD模型要求操作簡(jiǎn)單、成功率高、死亡率低、穩(wěn)定性好,易進(jìn)行后期藥物試驗(yàn)及機(jī)制研究。

6 PSD模型建立存在的問題及展望

目前各實(shí)驗(yàn)室建模仍存在諸多問題:(1)卒中模型建立后,其穩(wěn)定性及有效性無統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn);(2)神經(jīng)功能評(píng)定方法不一;(3)卒中模型建立后何時(shí)開始CUMS,每種CUMS模式刺激多長(zhǎng)時(shí)間以及CUMS的組合形式均無明確定論;(4)PSD建模成功后何時(shí)開始行為學(xué)評(píng)價(jià),哪一種或哪幾種行為學(xué)評(píng)價(jià)方法更能體現(xiàn)建模的成功,尚不明確;(5)PSD模型的興趣缺失癥狀是一過性的應(yīng)激刺激還是持續(xù)性的變化,尚不明確[28];(6)盡管某些實(shí)驗(yàn)室嘗試在方法學(xué)上進(jìn)行改良,但改良模型的可靠性有待考量。為促進(jìn)PSD發(fā)病機(jī)制及治療的研究,建立一個(gè)穩(wěn)定、標(biāo)化的動(dòng)物模型及行為學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。