張偉，杜鈺

新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實驗室/新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054

古菌（Archaea）也叫古細(xì)菌（Archaebacteria），是自然界三大生物類群之一（Martin，2005）。古菌可能是最古老的生命體，早先常被發(fā)現(xiàn)生活于各種極端自然環(huán)境下，如大洋底部的高壓熱溢口、熱泉、鹽堿湖等地（Martin，2005）。近年的研究表明，土壤中氨氧化是氮素轉(zhuǎn)化過程的第一步也是限速環(huán)節(jié)，而氨氧化古菌在農(nóng)田氨氧化過程中起著重要促進(jìn)作用（Hatzenpichler，2012）。由于大多數(shù)古菌都難以被培養(yǎng)和分離，有關(guān)其在土壤碳（C）、氮（N）、硫（S）、鐵（Fe）等元素循環(huán)過程中所起的作用，以及環(huán)境治理潛在的開發(fā)前景鮮見報道（包麗君等，2017）。

新疆是中國最早種植棉花的地區(qū)之一，也是目前中國唯一的長絨棉種植基地，棉花長期連作在當(dāng)?shù)厥菢O為普遍的現(xiàn)象（倪天麒等，2002）。由于新疆地區(qū)位于中亞腹地且遠(yuǎn)離海洋，其土壤和氣候具有相當(dāng)特殊性。在當(dāng)?shù)胤N植棉花需要采用地膜保墑、人工定期灌溉、大量施用氮肥和各種農(nóng)藥等人為干預(yù)措施（金建新，2008）。研究表明，這些農(nóng)作措施極大地改變了當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境（李騰等，2018），然而更多的研究是從土壤養(yǎng)分、理化性質(zhì)等角度進(jìn)行分析（王樹林等，2017），而有關(guān)棉花連作對古菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以及它們的改變與棉花連作障礙和土傳病害的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)性鮮有報道（陳一峰等，2015；Gloor et al.，2010）。

雖然傳統(tǒng)微生物研究手段難以深入開展土壤古菌群落結(jié)構(gòu)研究，但近些年發(fā)展起來的非培養(yǎng)技術(shù)手段為此類研究提供了契機。目前，高通量測序技術(shù)得到快速發(fā)展，不僅測序長度不斷增加，測序通量飛速提高，而且能夠用于對比分析的古菌數(shù)據(jù)量也不斷增大，目前該技術(shù)已成為最強有力的研究微生物生態(tài)系統(tǒng)的工具（李銳等，2015；Lazarevic et al.，2009）。本研究采用該方法對比分析了新疆地區(qū)原生態(tài)及長達(dá) 30年棉花連作過程中土壤古菌群落結(jié)構(gòu)組成和差異，有助于從土壤微生物生態(tài)的角度解析當(dāng)?shù)馗珊蝶}堿土壤環(huán)境下古菌群落結(jié)構(gòu)特征，以及土壤古菌群落結(jié)構(gòu)對棉花長期連作、其他作物輪作和與之配套的農(nóng)作措施產(chǎn)生的響應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

采樣時間、方式和位置：2015年6月5日（此時棉花枯萎病和黃萎病開始發(fā)作）于新疆阿瓦提縣棉田，依據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)技部門提供的信息，分別選擇棉花連作 0（未開墾土壤）、1、3、5、10、15、20、25、30 a的棉田和長年連作棉田改種玉米1年的農(nóng)田為研究對象，所有樣地（2500畝，約為166.67 hm2）集中在新疆阿瓦提縣，采 樣 范 圍 在 79°45′81″－ 79°46′55″E ， 39°31′47″－39°45′50″N 之間。采用“五點”取樣法采集土壤樣品，在每一連作年限樣地的地頭、地中、地腳各隨機選擇 5株棉花或玉米，用內(nèi)徑為6 cm的土鉆在距植株5 cm處垂直打下，取1－20 cm深度土壤。將15個相同連作年限土壤合并為1個土樣，共計10個土樣。按連作年數(shù)依次編號為 AWTG0、AWTG1、AWTG3、AWTG5、AWTG10、AWTG15、AWTG20、AWTG25、AWTG30和AWTGL。土樣采集后于-4 ℃保存，帶回實驗室，一周內(nèi)完成DNA提取、測序。

1.2 DNA提取、PCR擴增和高通量測序（DNA extraction，PCR and pyrosequencing）

土壤樣品總DNA的提取使用FastDNA? spin kit（MP bio，Santa Ana，USA），操作方法按照試劑盒說明，每個樣品做 3個重復(fù)。各重復(fù)樣品總DNA按照相同的量合并后儲存于-80 ℃下冰箱中，備用。使用PARCH519R（CAGCCGCCGCGGTAA）/ARC915R（GTGCTCCCCCGCCAATTCCT）引物來擴增各樣品總DNA的16S rRNA基因V4+V5片斷（Ovreas et al.，1997；Muyzer et al.，1993）。30 μL 反應(yīng)體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，上下引物各 1.5 μL（2 μM），各樣品 DNA（1 ng·μL-1）10 μL，雙蒸水 2 μL。Bio-rad T100梯度 PCR 儀，反應(yīng)程序：98 ℃，1 min；98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共3O個循環(huán)；72 ℃，5 min后穩(wěn)定在4 ℃。紫外分光光度計（NanoDrop-1000，USA）準(zhǔn)確定量擴增獲得的各樣品16S rRNA基因519－934區(qū)片段，各樣品等濃度充分混勻后，在1×TAE、2%瓊脂糖膠中電泳后，使用 Thermo Scientific公司 GeneJET膠回收試劑盒回收 280－450 bp的主帶。上述樣品使用New England Biolabs公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后于Illumina HiSeq平臺上機測序。本文所測得的序列在 NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中的登錄號為SRS1624762。

1.3 生物信息和統(tǒng)計分析（Bioinformatics and statistical analysis）

Novogene公司自編腳本被用于截去Barcode和引物序列，每個樣品上游引物序列前端有6 bp的特征序列用于區(qū)別不同的樣品，各樣品優(yōu)化后可供精準(zhǔn)分析的序列至少40000條以上（Magoc et al.，2011）。UPARSE pipeline（v7.0.1001）被用于對獲得的各樣品序列進(jìn)行OTU等相關(guān)生物信息分析，相似度設(shè)置為97%。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用RDP Classifier（Version 2.2，http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）方法與 GreenGene數(shù)據(jù)庫（http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8－1），并分別在各個分類水平：kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計各樣本的群落組成。

運用Qiime軟件（Version 1.7.0）分析各樣品的αDiversity并計算 Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage指數(shù)，運用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線、物種累積曲線、韋恩圖；并進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析（Caporaso et al.，2010）。在β Diversity分析中，運用Qiime（Version 1.7.0）軟件計算weighted和unweighted Unifrac距離并構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹。運用R語言vegan包vegdist和hclust進(jìn)行樣品相似度聚類、OUT熱圖和 β多樣性距離計算及熱圖（PCA、PCoA和NMDS等圖）繪制，其中PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，PCoA分析使用R軟件的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包（Wang et al.，2007）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品古菌群體數(shù)據(jù)

10個樣品中可用于精準(zhǔn)分析的序列共有626590條，平均長度為383 bp，其中AWTG30樣品隸屬于古菌界的序列數(shù)最少，為45937條。各樣品獲得的有效序列數(shù)達(dá)到40000條時，可檢測到種的飽和度曲線已接近平臺期，測序錯誤率小于 1%堿基比率（Q20）和 0.1%堿基比率（Q30）分別達(dá)98.34%和 96.6%以上，所有樣品覆蓋度介于 0.992－0.997之間（表1）。從界到種水平上，各樣品獲得的能用于準(zhǔn)確分類的序列數(shù)量比例較接近，但不能被準(zhǔn)確分類的序列數(shù)隨著分類精度的提高不斷增多，其中在門分類水平最多只有 2.05%（AWTG25）的序列不能被分類（圖1A），而在屬水平上不能被明確分類的序列最多達(dá)到了 66.7%（AWTG15）（圖1B）。

2.2 α多樣性指數(shù)及OTU

各菌群多樣性指數(shù)中，AWTG0樣品 Shannon指數(shù)最低為4.76，其次是AWTG30樣品，為5.335，最高的是AWTGL樣品，為6.269，且各棉花連作樣品 Shannon指數(shù)在連作過程中表現(xiàn)出反復(fù)波動（表 1）。各樣品 Simpson、Chao1和 ACE指數(shù)與Shannon指數(shù)變化結(jié)果比較一致，最低的都是AWTG0，但Simpson指數(shù)最高的是AWTG10樣品，為 0.945，Chao1和 ACE指數(shù)最高的都是樣品AWTG25，分別為1604.915和1711.09。這3個指數(shù)在連作過程中也表現(xiàn)出反復(fù)波動，但波動的幅度和頻率各不相同（表1）?？蓺w類的OTU數(shù)量中，AWTG0樣品最低為 763，其他各樣品 OTU數(shù)在1091（AWTG30）－1626（AWTG25）之間，AWTGL樣品介于中間水平，為1605（圖2）。對比分析各樣品OTU差異，其中所有樣品共有的OTU有232個。各樣品特有OTU中，原生態(tài)樣品為80個，各連作樣品特有 OTU數(shù)介于 14（AWTG30）－125（AWTG25）之間，而所有樣品中 AWTGL最多，為127個（圖3）。

表1 10個不同連作年限土樣古菌群落群體數(shù)據(jù)及多樣性指數(shù)Table 1 Diversity of the 10 soil samples in archaea with different succession cropping histories

圖1 各樣品中古菌豐度最大的前10個門（A）和屬（B）占比Fig. 1 Abundances of different phylums (A) and genus (B) in archaea， the abundance is presented in terms of percentage in total effective archaea sequences in the 10 soil samples

2.3 原生態(tài)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)特征及對棉花連作后產(chǎn)生的響應(yīng)

在門分類水平上，當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)土壤古菌群落主要由Thaumarchaeota（47.91%）、SM1K20（37.07%）、Euryarchaeota（3.51%）、Aenigmarchaeota（3.32%）、Crenarchaeota（2.78%）和 Marine_Hydrothermal_Vent_Group（MHVG）（2.32%）等6個豐度占比較大的門組成（總占比為 96.93%）。棉花長期連作過程中Thaumarchaeota和Crenarchaeota的豐度無明顯變化，SM1K20的豐度出現(xiàn)大幅度下降（平均為15.82%），Euryarchaeota的豐度出現(xiàn)大幅度上升（平均為16.44%），Aenigmarchaeota的豐度增長了1倍，Marine_Hydrothermal_Vent_Group（MHVG）的豐度減少為原來的1/11（圖1A）。在屬分類水平上，當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)土壤古菌群落結(jié)構(gòu)中有 66.23%以上尚不能被準(zhǔn)確分類，其余的主要由Candidatus_Nitrososphaera（9.74%）、unidentified_SM1K20（8.46%）、unidentified_Soil_Crenarchaeotic_Group（SCG）（5.16%）、Candidatus_Aenigmarchaeum（2.24%）、uncultured_Sulfolobaceae（2.16%）和Candidatus_Nitrosopumilus（1.78%）等6個豐度占比較大的屬組成；而棉花連作后Candidatus_Nitrososphaera和Candidatus_Aenigmarchaeum的豐度增加近1倍，unidentified_SM1K20和uncultured_Sulfolobaceae的豐度無明顯變化，unidentified_Soil_Crenarchaeotic_Group（SCG）的豐度依據(jù)連作年限不同出現(xiàn)巨大波動，Candidatus_Nitrosopumilus的豐度減少了近8倍（圖1B）。玉米輪作1年使得豐度占比最大的10個屬中Sulfolobaceae和GoM-Arch87的豐度成倍增加（圖1B）。

圖2 各樣品中古菌測得的序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息及其OTU數(shù)Fig. 2 Total tags， taxon tags， unclassified tags， unique tags and OTUs of the 10 samples

圖3 各樣品中特有及共有OUT數(shù)Fig. 3 Venn diagram of unique number of OTUs in the 10 soil samples

2.4 樣品間古菌群體結(jié)構(gòu)β多樣性比較

unweighted unifrac聚類結(jié)果顯示原生態(tài)樣品單獨為一族，而棉花連作的樣品聚在了一大族，其中又以連作年限長短不同明顯分為2族，輪作樣品被聚在長期連作族（圖4A）。weighted unifrac聚類結(jié)果明顯不同，該聚類方法是所有樣品按連作年限長短直接將其分為2族，其中原生態(tài)樣品和輪作樣品被聚在長期連作族，但原生態(tài)樣品與其他連作樣品差異較大，而輪作樣品與長期連作樣品差異很?。▓D4B）。主坐標(biāo)分析（PCoA）的unweighted數(shù)據(jù)顯示，原生態(tài)樣品與其他樣品距離較遠(yuǎn)，而棉花連作年限長和短的又相對各成為一個群體分別位于橫軸的上下方，且輪作樣品與連作年限長的樣品較集中（圖5A）；weighted數(shù)據(jù)顯示原生態(tài)樣品與輪作樣品距離較近，而棉花連作年限長和短的又相對各成為一個群體，分別位于第一、三象限（圖5B）。非度量多維尺度結(jié)果（NMDS）顯示，原生態(tài)樣品與所有連作樣品間距離非常大，而且連作年限長的樣品和輪作樣品相對集中且?guī)缀跞恐丿B，連作年限短的樣品相對集中且?guī)缀跞恐丿B（圖6）。

3 討論

3.1 新疆地區(qū)土壤古菌資源及其與環(huán)境的適應(yīng)性

圖4 各樣品古菌群落結(jié)構(gòu)相似度聚類Fig. 4 Analysis of sample similarity in the 10 soil samples

圖5 各樣品古菌群落結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析Fig. 5 Principal Coordinate Analysis (PCoA) of 10 soil samples calculated with QIIME

圖6 各樣品NMDS plots分析Fig. 6 Nonmetric Multidimensional Scaling (NMDS) analysis of the 10 soil samples

古菌群落結(jié)構(gòu)特征與其生存環(huán)境密不可分，可作為特定地質(zhì)環(huán)境的標(biāo)志物（曹鵬等，2012）。新疆地處中亞腹地，氣候干旱少雨，土壤鹽漬化極嚴(yán)重，被開墾作為棉田的土地多分布在綠洲和沙漠之間的過渡帶，植被稀疏、土壤有機質(zhì)含量極少，且富K、少P、缺N，pH值平均8.52以上，諸如此類土壤環(huán)境下的古菌群落結(jié)構(gòu)組成研究少有報道（韓春麗等，2010）。通過對當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)土壤環(huán)境樣品（AWTG0）序列數(shù)據(jù)分析可知，其中的古菌門類群多達(dá)14個。豐度最大的 Thaumarchaeota（奇古菌門）在該環(huán)境中占比 47.91%，而已有關(guān)于 Thaumarchaeota的報道認(rèn)為其具有氧化氨獲得能量的功能（沈菊培等，2011；陳玉連等，2017；Noah et al.，2003），這與當(dāng)?shù)赝寥览砘匦圆环?，因?Thaumarchaeota在當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境中的功能有待深入研究。目前有關(guān)Euryarchaeota和Crenarchaeota門古菌研究報道相對較多，并認(rèn)為她們是海洋水環(huán)境和沉積物中的優(yōu)勢種群，當(dāng)中包含許多產(chǎn)甲烷菌、耐鹽的鹽桿菌、嗜熱菌等（張麗梅等，2012），但本研究發(fā)現(xiàn)這兩個門的古菌在當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)土壤環(huán)境中分別也占有 3.51%和2.78%的豐度，其中原因值得深入研究。SM1K20門多為尚未分離鑒定的古菌（Durbin et al.，2012），其功能研究報道也微乎其微，而其豐度在該環(huán)境中占比達(dá)37.1%，處于第二位。被認(rèn)為是由小的古菌細(xì)胞組成的Aenigmarchaeota門（范習(xí)貝等，2017）在該環(huán)境中的豐度也達(dá)到了3.32%。此外，該原生環(huán)境中豐度較高的門還有 Marine_HydrothermaVl_ ent_Group（MHVG）（2.32%），Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group（1.36%）。推測該土壤環(huán)境雖然較為苛刻，但孕育的特有未知古菌資源較為豐富，對其在當(dāng)?shù)赝寥郎鷳B(tài)中的功能展開深入研究有助于挖掘該環(huán)境下的古菌資源。

3.2 當(dāng)?shù)赝寥拦啪郝鋵γ藁ㄟB作產(chǎn)生的響應(yīng)

眾所周知，土壤是最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一，氣候條件、土壤理化性質(zhì)等都是影響土著微生物群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素（Pimental et al.，1992）。新疆棉區(qū)由于作物種類單一等因素，在一個小區(qū)域內(nèi)同時存在連作不同年限（0－30 a）的棉田，這給研究古菌群落適應(yīng)土壤的開墾和棉花連作的響應(yīng)提供了很大的便利。首先，所有耕作樣品α和β多樣性指數(shù)變化規(guī)律都表明土壤開墾是導(dǎo)致當(dāng)?shù)赝寥拦啪鄻有陨仙闹苯右蛩?，而且耕作的第一年升高幅度最大。分析認(rèn)為定期灌溉、施氮肥等農(nóng)業(yè)管理措施極大地改變了當(dāng)?shù)赝寥览砘再|(zhì)（Zhang et al.，2013），致使被檢測到的古菌種屬的數(shù)量和豐度都有較大幅度的提高。其次，所有樣品形成一種按連作年限長短各自聚類和調(diào)整幅度逐漸趨小的走勢，并在棉花多年連作后最終形成新的相對穩(wěn)定的古菌群落結(jié)構(gòu)。推測土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的這種變化過程和當(dāng)?shù)匕肽旮靼肽晷萏锏脑耘喾绞接幸欢P(guān)聯(lián)，因為土壤古菌群落組成可以在每年棉花春夏耕作期間發(fā)生適應(yīng)性調(diào)整，而在冬秋休田期間進(jìn)行部分恢復(fù)。第三，本研究主要在門分類水平對比各樣品間不同類群豐度和幅度的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了耕作對古菌群落結(jié)構(gòu)造成的影響。至于棉花連作過程中的變化規(guī)律則需要在較低分類水平上進(jìn)行對比分析，但由于可以用來準(zhǔn)確對比并定位這些序列所代表的菌屬及其功能的信息有限，因此不適合深度解析其關(guān)聯(lián)性。對于能被準(zhǔn)確分類的序列，依然可以分析其隨連作年限延長而表現(xiàn)出的規(guī)律性變化。比如，在綱分類水平，Aenigmarchaeota_Incertae_Sedis是連作之后豐度才增加的。在目分類水平，Sulfolobales的豐度在耕作前后均無明顯變化。在屬分類水平，Candidatus_Nitrososphaera非常明確地表現(xiàn)出隨連作年限延長而豐度遞增的趨勢，這和該屬具有氨氧化功能（李明等，2017）及因當(dāng)?shù)蒯槍ν寥览砘匦远扇〉囊允┑蕿橹鞯拇胧┍容^相符。另外，栽培作物改為玉米后，引起個別古菌屬的組成豐度發(fā)生較大調(diào)整，其中的關(guān)聯(lián)和輪作能降低棉花病蟲害的具體原因都值得深入研究。

4 結(jié)論

（1）新疆阿瓦提縣原生態(tài)土壤含有豐富的特有古菌資源。當(dāng)?shù)赝寥赖拈_墾和棉花的種植極大地改變了古菌群落結(jié)構(gòu)組成并提高了其多樣性。棉花的長期連作促使形成了新的古菌群落結(jié)構(gòu)組成。棉花和玉米輪作能快速調(diào)整一些古菌屬的豐度，研究其關(guān)系有助于更好地闡釋作物與古菌間的互作機制。