張孟爽 牛敏 劉淑敏 杜娜 堯靜 陳辭言 杜艷,*

(1 中國云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650032；2 菏澤市立醫(yī)院，菏澤，274100；3 云南省中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650021)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)的一種，在我國患病率逐年上升，其特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量較低。UC的病因及發(fā)病機(jī)制不清，腸道微生物與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。UC發(fā)病機(jī)制可能為腸道菌群失調(diào)以及腸黏膜屏障功能缺陷，腸道致病菌侵入黏膜下層，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡，炎性細(xì)胞活化，使腸黏膜產(chǎn)生炎癥。此過程可由TLRs介導(dǎo)，通過下游信號(hào)傳遞分子MyD88胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致NF-κB激活和轉(zhuǎn)位，產(chǎn)生致炎因子TNF-α、IL-1β等，進(jìn)一步破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致UC發(fā)生。

臨床上在使用常規(guī)治療方案的同時(shí)，可輔以使用益生菌制劑，從而使UC患者腸道菌群失調(diào)程度降低，以減輕患者的炎癥反應(yīng)[3]。VSL#3是一種益生菌混合物，含菌量較高，含有8種常見的人體腸道有益菌種(4種乳桿菌屬、3種雙歧桿菌屬和1種鏈球菌屬)，2009年的兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)的結(jié)果均顯示VSL#3對(duì)UC的誘導(dǎo)緩解有效[4-5]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)益生菌VSL#3能修復(fù)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠受損的結(jié)腸組織，緩解炎癥癥狀，并可有效降低結(jié)腸組織促炎因子IL-6，TNF-α的含量，提高抗炎因子TGF-β、IL-10的含量，阻斷炎癥反應(yīng)，縮短炎癥持續(xù)時(shí)間。益生菌VSL#3可以降低腸道菌群失調(diào)嚴(yán)重程度，一定程度降低菌群失調(diào)率，提高雙歧桿菌、擬桿菌等益生菌的比例[6]。綜上所述，益生菌VSL#3的治療作用是否與TLR-4通路有關(guān)值得進(jìn)一步探討。

為了深入研究益生菌VSL#3對(duì)UC免疫信號(hào)通路TLR4-NF-κB的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究使用DSS構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，然后采用real-time PCR、Western-Blot檢測(cè)結(jié)腸組織中該通路上下游因子的表達(dá)情況，同時(shí)使用ELISA檢測(cè)治療前后大鼠血清中致炎因子TNF-α、IL-1β水平的變化。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

健康6～7周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～220g。實(shí)驗(yàn)正式開始前7d適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào): SCXK(滇)k2015-0002。

1.2 分組

動(dòng)物模型構(gòu)建：稱取DSS 50g，加入去離子水定容至1000mL，配制成5%DSS溶液，根據(jù)實(shí)際飲用量，每日新鮮配置，自由飲用一周。7d后，DSS造模組自由飲用去離子水1周，益生菌治療組使用益生菌VSL#3(菌量為105cfu/天)灌胃一周，第8天處死大鼠，收集大鼠的血清和結(jié)腸組織。具體分組情況如下：33只大鼠隨機(jī)分組，A：空白對(duì)照組(3只)；B：DSS造模組(15只)；C：益生菌VSL#3治療組(15只)。

1.3 儀器與試劑

ABI7500型定量PCR儀(美國ABI公司)，Biorad轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-rad公司)，紫外分光光度計(jì)(美國Thermoscientific公司)，化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-rad公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司)。硫酸葡聚糖鈉(美國MPBIO)，益生菌VSL#3(美國Ferring Pharmaceuticals Inc)，Eastep?Super總RNA提取試劑盒、GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及GoTaq?qPCR Master Mix均為普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，TLR4 兔抗鼠抗體(SANTA)，NF-κB p65兔抗鼠抗體(proteintech)。Rat IL-1beta ELISA Kit(聯(lián)科生物)，Rat TNF-α ELISA Kit(聯(lián)科生物)。

1.4 方法

1.4.1 疾病活動(dòng)指數(shù)及組織學(xué)評(píng)分

計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI評(píng)分)以及組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1～2。體重下降=(當(dāng)日體重-造模結(jié)束時(shí)體重)/ 造模結(jié)束時(shí)體重

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸組織MyD88、TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)

RNA的提取使用普洛麥格總RNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。引物序列如下(表3)。

1.4.3 Western-Blot檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65的表達(dá)

把組織剪切成細(xì)小的碎片，使用液氮將組織充分研磨，稱取20mg組織于無菌EP管內(nèi)，加入150μL RIPA裂解液(已加入PMSF)，充分裂解后，14000g離心5min，取上清，分裝，做好標(biāo)記放于-80℃保存。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后制備SDS-PAGE凝膠，蛋白變性，電泳(壓縮膠80V 30min，分離膠120V 1h)，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)，120V 1h, PVDF膜)，封閉，抗體孵育等，經(jīng)ECL發(fā)光后，于成像系統(tǒng)拍照。

表1 DAI評(píng)分表Tab.1 DAI score

表2 組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Histology injury score

表3 引物序列Tab.3 Primer sequence

1.4.4 ELISA檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-1β蛋白的表達(dá)

分離管分離血清，取血后使血樣凝集30min，1000g離心10min。分裝，儲(chǔ)存于-20℃冰箱(減少凍融次數(shù))。實(shí)驗(yàn)開始前取出冷凍樣本，恢復(fù)至室溫，緩慢混勻。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，計(jì)算OD值，利用軟件進(jìn)行回歸擬合以生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用回歸分析確定最佳擬合曲線

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用IBM spss 24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間差異比較用方差t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疾病活動(dòng)指數(shù)及組織學(xué)評(píng)分

2.1.1 一般情況

除空白對(duì)照組外，自由飲用5%DSS的第4天，幾乎所有大鼠均出現(xiàn)肉眼血便，繼續(xù)飲用5%DSS至7d。從8d開始，VSL#3治療組使用益生菌VSL#3進(jìn)行灌胃治療。在益生菌治療過程中，空白對(duì)照組大鼠毛色光滑，正常進(jìn)食，大便成型；DSS造模組大鼠食量減少，毛色干枯無光澤，稀便，部分大鼠出現(xiàn)黏液膿血便或血便，肛門口可見血跡；VSL#3治療組大鼠毛色欠光滑，反應(yīng)欠靈活，腹瀉或血便，但與DSS造模組相比，情況較好。經(jīng)過益生菌VSL#3治療一周后，益生菌治療組DAI積分與DSS模型組相比，顯著降低(t=1.8,P=0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.2 病理學(xué)評(píng)分

益生菌治療一周后，取大鼠結(jié)腸組織，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。HE染色部分圖片如圖1所示?？瞻讓?duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞連續(xù)性完整，隱窩未破壞，腺體排列整齊，固有層無炎癥細(xì)胞浸潤；DSS造模組結(jié)腸黏膜有多處糜爛及潰瘍?cè)?，腺體不同程度增生且排列紊亂，伴有隱窩膿腫或隱窩炎，固有層可見大量以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤；VSL#3治療組腸黏膜病理學(xué)損傷均有不同程度的緩解，結(jié)腸黏膜的糜爛潰瘍?cè)罴半[窩炎和隱窩膿腫明顯減少，病變范圍縮小，炎癥細(xì)胞浸潤亦顯著減少。對(duì)大鼠結(jié)腸組織病理切片進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分：空白對(duì)照組大鼠大腸組織學(xué)損傷評(píng)分為零，DSS造模組評(píng)分最高，為7.8±1.04。益生菌治療組評(píng)分為5.4±0.8，低于DSS造模組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。HE染色部分圖片如圖1所示。

2.2 Real-time PCR結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，DSS造模組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，經(jīng)益生菌VSL#3治療后，與DSS造模組相比益生菌治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)降低(P＜0.05)。各因子相對(duì)表達(dá)量見表4。

2.3 Western-Blot 結(jié)果

圖1 大鼠結(jié)腸組織HE染色(×400)Fig.1 Histology were observed under the microscope graph(×400)

表4 各因子3組相對(duì)表達(dá)量差異比較(x±s)Tab.4 Relative expression of each factor (x±s)

Western-blot檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65的表達(dá)，BCA定量，蛋白上樣量為50μg, DSS造模組TLR4、NF-κBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高，分別為0.847±0.057，1.873±0.129，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)過益生菌VSL#3治療一周后，與造模組相比，TLR4、NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。蛋白表達(dá)情況見圖2。

2.4 ELISA結(jié)果

使用ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-1β和TNF-α表達(dá)水平，DSS造模組血清IL-1β和TNF-α的表達(dá)最高，經(jīng)益生菌VSL#3治療一周后，與DSS造模組相比益生菌治療組血清IL-1β和TNF-α的表達(dá)顯著降低(P＜0.001)。結(jié)果見表5。

圖2 各組TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of TLR4 and NF-κB p65

3 討論

目前認(rèn)為，腸道菌群的改變是誘發(fā)和維持結(jié)腸炎癥的主要原因。Macfarlane等[7]應(yīng)用16S rRNA探針熒光原位雜交法研究UC患者直腸活檢標(biāo)本中的菌群發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌比正常對(duì)照減少約30倍，且UC患者與正常對(duì)照中雙歧桿菌優(yōu)勢(shì)菌群亦有明顯不同。本課題組前期研究也有類似發(fā)現(xiàn)：潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群失調(diào)率和菌群失調(diào)程度明顯高于健康對(duì)照組；益生菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)率降低，需氧和厭氧的條件致病菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)率增加[8]。從大量的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過調(diào)節(jié)失衡的腸道菌群，發(fā)揮其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。本研究中，經(jīng)過益生菌VSL#3治療一周后，治療組大鼠腹瀉、血便等癥狀減輕，體重下降幅度降低，DAI評(píng)分明顯降低，腸黏膜缺失減少，固有層炎癥細(xì)胞浸潤減少等，說明益生菌VSL#3對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠有治療效果。

表5 大鼠血清TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平(pg/mL)Tab.5 Expression of TNF-α and IL-1β protein in rat serum (pg/mL)

TLR屬于I型跨膜蛋白受體，目前發(fā)現(xiàn)的TLR有13種，其中TLR-4主要識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖(LPS)[9]。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，與免疫和炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞生長(zhǎng)、病毒感染等密切相關(guān)。NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中與它的抑制因子I-κB結(jié)合，以不活動(dòng)的狀態(tài)存在，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，NF-κB的抑制因子I-κB磷酸化，將NF-κB從I-κB復(fù)合物中釋放出來，釋放出來的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中，與特異性的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄。腸道菌群失調(diào)以及腸黏膜屏障功能缺陷，使腸道致病菌侵襲黏膜下層，在各種微生物抗原刺激下，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，細(xì)胞因子釋放失衡，活化各種炎癥細(xì)胞致腸黏膜組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。該過程可由TLRs介導(dǎo)，通過下游信號(hào)傳遞分子MyD88胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致NF-κB激活和轉(zhuǎn)位，產(chǎn)生致炎因子TNF-α、IL-1β等，進(jìn)一步破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致UC發(fā)生。何斌等[10]研究發(fā)現(xiàn)，UC患者外周血中單核細(xì)胞中TLR4和NF-κB呈高表達(dá)狀態(tài)，且TLR4的表達(dá)與NF-κB的表達(dá)密切相關(guān)。

空白對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織TLR4 、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA僅有少量表達(dá)，血清TNF-α、IL-1β水平較低，DSS造模成功后，大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB等分子在mRNA水平的表達(dá)明顯升高，同時(shí)ELISA結(jié)果顯示血清中釋放的TNF-α、IL-1β水平顯著升高，證明DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎形成的過程中，TLR4信號(hào)通路被激活，從而引起該通路下游因子TNF-α、IL-1β和炎性介質(zhì)大量釋放，導(dǎo)致結(jié)腸組織損傷，結(jié)腸炎形成。經(jīng)灌胃給予益生菌VSL#3治療1周后，大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)降低，同時(shí)血清中TNF-α、IL-1β的水平也顯著降低。該結(jié)果提示益生菌VSL#3可抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路基因的激活，使其下游細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放減少，減輕結(jié)腸炎癥損傷，從而發(fā)揮其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。