骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與黃芪多糖的干預(yù)研究

鄧聰，楊志敏，徐福平，孫玉姣，陳玉狀，賴艷嫻，岑美婷

(1.廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院，廣東 廣州 511457；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120)

人體質(zhì)量的40%～50%由骨骼肌組成[1]，骨骼肌是人體內(nèi)最大的器官系統(tǒng)。在人體衰老的進(jìn)程中，骨骼肌是最早受到影響的組織之一[2]，并表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的變化，如功能障礙和質(zhì)量損失。大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)導(dǎo)致了骨骼肌萎縮，增加的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)促進(jìn)了骨骼肌萎縮的發(fā)生，累積的ROS可促進(jìn)蛋白質(zhì)水解增加并抑制蛋白質(zhì)合成[3]。因此，減少骨骼肌中ROS和抑制OS，對(duì)于預(yù)防和治療骨骼肌萎縮很關(guān)鍵。文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)有良好的抗氧化作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過建立氧化應(yīng)激骨骼肌細(xì)胞模型，觀察APS對(duì)其的影響，為今后的實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)：C2C12骨骼肌細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，使用含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM，在37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2～3 d/傳代，待進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

APS(美國泛華生物公司)；新生胎牛血清、青霉素和鏈霉素(四季青生物工程研究所)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；DCFH-DA、過氧化氫(H2O2)(Sigma公司)；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物有限公司)。

1.2 氧化應(yīng)激骨骼肌細(xì)胞模型

將對(duì)數(shù)生長良好的骨骼肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(密度5×104/mL)，根據(jù)H2O2濃度分為4組：100 μM(100組)、200 μM(200組)、300 μM(300組)、400 μM(400組)及正常組，每組6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h。MTT法檢測(cè)(設(shè)調(diào)零組)，每孔加入50 μL MTT，37℃溫育4 h，吸棄上清液，加入200 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上用570 nm波長檢測(cè)各孔OD值。

1.3 細(xì)胞增殖率

將對(duì)數(shù)生長良好的骨骼肌細(xì)胞，分為3組：正常組、100 μM H2O2組(模型組)、100 μM H2O2+0.2 mg/mL APS組(干預(yù)組)，每組6個(gè)復(fù)孔并培養(yǎng)24 h。MTT法檢測(cè)(方法同上)。

增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%

1.4 細(xì)胞凋亡率

上述3組培養(yǎng)24 h后，用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)。用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)取1×106/mL細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶染色液混勻，溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞ROS水平

上述三組培養(yǎng)24 h后，用DCFH-DA探針標(biāo)記法檢測(cè)。用胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞懸浮于濃度為10 μM的DCFH-DA中，密度1×106/mL，37℃孵育20 min，用不含血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次以除去DCFH-DA，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的H2O2對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響

與正常組比較，100組、200組、300組和400組在12 h、24 h內(nèi)骨骼肌細(xì)胞的增殖率均顯著下降(P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.01。圖1 不同濃度的H2O2對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響

2.2 各組增殖率、凋亡率、ROS水平的比較

與正常組比較，模型組和干預(yù)組的增殖率均下降，凋亡率和ROS水平均升高(P<0.01)。與模型組比較，干預(yù)組的增殖率上升，凋亡率和ROS水平均下降(P<0.01)。見圖2。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。圖2 各組增殖率、凋亡率、ROS水平的比較

3 討論

衰老是一個(gè)依賴于時(shí)間的生理過程，也是人類慢性病發(fā)生和發(fā)展的最大風(fēng)險(xiǎn)因素。由于人類對(duì)預(yù)期壽命的增加，研究衰老變得尤為重要。人類在25周歲之后，骨骼肌質(zhì)量就以3%～10%/10年的速度丟失。隨著年齡增長而發(fā)生的骨骼肌質(zhì)量和功能的進(jìn)行性減退，稱為骨骼肌減少癥，也稱肌肉減少癥(Sarcopenia)[1]，已被公認(rèn)為老年綜合癥。大量研究指出，骨骼肌能夠控制其他組織代謝或衰老的速度，是年齡相關(guān)疾病(Age-related diseases，ARD)發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，如代謝綜合征、阿爾茨海默氏癥、慢性心衰、癌癥等[5]。因此，骨骼肌是人體組織衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

氧化還原紊亂導(dǎo)致肌肉萎縮的假設(shè)最早在1991年由Kondo等[5]提出。Pham等[6]研究發(fā)現(xiàn)，將肌細(xì)胞暴露于H2O2中，可使其蛋白質(zhì)合成減少約90%。本實(shí)驗(yàn)中，H2O2濃度在100 μM以上各組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示100 μM H2O2是氧化應(yīng)激骨骼肌細(xì)胞模型的有效濃度。隨著H2O2濃度的增加，骨骼肌細(xì)胞的增殖率顯著下降(P<0.01)。研究指出，ROS在骨骼肌中積累導(dǎo)致的氧化還原狀態(tài)改變，在肌肉減少癥中發(fā)揮重要作用[7]。本實(shí)驗(yàn)用100 μM H2O2制作氧化應(yīng)激骨骼肌細(xì)胞模型，結(jié)果顯示模型組的ROS水平及凋亡率均顯著升高(P<0.01)。

肌肉減少癥相當(dāng)于中醫(yī)的“痿證”“虛勞”等證，主要病機(jī)為脾腎虧虛?！毒霸廊珪て⑽浮吩唬骸熬?，必賴后天為之資。故人自生至老，凡先天之有不足者，但得后天培養(yǎng)之力，則補(bǔ)天之功亦可居其強(qiáng)半?！庇纱丝梢姡a(bǔ)脾益氣是延緩衰老的關(guān)鍵。中藥黃芪具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、延緩衰老、神經(jīng)保護(hù)等[8]，APS是其主要活性成分占50%以上。本實(shí)驗(yàn)予0.2 mg/mL APS干預(yù)后，骨骼肌細(xì)胞的增殖率顯著升高(P<0.01)，ROS水平及凋亡率均顯著下降(P<0.01)，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)。提示APS有良好的抗氧化，改善肌肉減少癥的作用，但具體的分子機(jī)制有待我們下一步的研究。