肖懷秋，李玉珍*，劉 軍，周 全，姜明姣

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000）

亞鐵（Fe2+）是含鐵蛋白（酶）的關(guān)鍵組分，在攜氧運(yùn)輸、蛋白質(zhì)與核酸等大分子合成、生物氧化、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞增殖與分化等過程中具有重要作用[1-2]，亞鐵不足可引發(fā)缺鐵性貧血（iron-deficiency anemia，IDA）、帕金森?。≒arkinson"s disease，PD）和阿茲海默?。ˋlzheimer"s disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病。多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)含有大量螯合金屬陽離子的有效部位，其一級(jí)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、表面配位鍵及動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵等可實(shí)現(xiàn)多肽分子與金屬的配位螯合[3]；一級(jí)結(jié)構(gòu)中的羧基O原子、咪唑基N原子及巰基S原子等具有較強(qiáng)給電子能力，易與金屬離子發(fā)生配位螯合[4]；除N-端氨基和C-端羧基及氨基酸側(cè)鏈某些基團(tuán)可供配位之外，多肽鏈中的羰基和亞氨基也可參與金屬配合[5-6]，金屬配位有高度定向性，且配位螯合后可有效影響多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)并調(diào)控其生物學(xué)活性[7]，以多肽為配體螯合金屬離子制備金屬營養(yǎng)補(bǔ)充劑是當(dāng)前重要的制備策略。

食物中大部分以高價(jià)鐵（Fe3+）形式存在，吸收效率低，只有以亞鐵形式存在時(shí)，生物利用率才高且結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，易為人體胃腸道消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。亞鐵藥物補(bǔ)充主要以無機(jī)鐵鹽或簡單有機(jī)酸鐵鹽進(jìn)行，存在穩(wěn)定性差、胃腸刺激大、易受腸內(nèi)容物干擾、生物利用率低和存在一定毒副作用等缺陷，補(bǔ)充效果不理想[8]。生物多肽與亞鐵配位螯合后可明顯改善亞鐵吸收利用率和穩(wěn)定性，并能減少金屬元素間拮抗[9]，且多肽與亞鐵螯合后能以完整多肽被腸上皮細(xì)胞吸收，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟代謝利用，具有吸收率高，毒副作用少和安全邊際高等優(yōu)點(diǎn)[10]?；ㄉ呐c亞鐵經(jīng)配位螯合制備成花生肽亞鐵（peanut peptide-ferrous，PPF）營養(yǎng)補(bǔ)充劑后，其穩(wěn)定性是應(yīng)用研究的基礎(chǔ)，研究其穩(wěn)定性可為花生肽亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑的制劑研究和探索儲(chǔ)運(yùn)條件提供良好的理論支持。目前，亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑的研究主要有鱈魚多肽亞鐵[11]、羅非魚膠原蛋白肽亞鐵[12]、帶魚蛋白多肽亞鐵[13]、林蛙膠原蛋白多肽亞鐵[14]、米蛋白肽亞鐵[15]以及本課題研究的花生多肽亞鐵[10，16]等。但目前，關(guān)于多肽亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑的穩(wěn)定性研究鮮見。本研究以花生多肽（分子質(zhì)量＜1.0kDa）為配體，以氯化亞鐵（FeCl2），采用液相合成法制備得到花生肽亞鐵金屬配位螯合物，研究確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，考察其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及醇溶性，為花生肽亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑的制劑研究和探索儲(chǔ)運(yùn)條件提供良好的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生肽亞鐵螯合物：實(shí)驗(yàn)室自制[10]；無水乙醇、氫氧化鈉，鹽酸，硫酸、醋酸、乙酸鈉、硫酸亞鐵銨、鹽酸羥銨：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰菲啰啉：天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有本實(shí)驗(yàn)使用的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2500紫外可見分光光度計(jì)、IRPrestige-21傅立葉變換紅外光譜儀：日本島津公司；HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)：德國Hermle公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；AL204分析天平：梅特勒-托利多集團(tuán)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州予華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的制備工藝

以分子質(zhì)量＜1.0 kDa為配體，以氯化亞鐵為金屬配位螯合劑，在多肽：亞鐵配比為4.31∶1（g∶g）、25.4 ℃和pH 7.5條件下螯合28.5min，用無水乙醇沉淀，靜置2h并于8000r/min條件下離心20 min，制備得到花生肽亞鐵螯合物，經(jīng)紫外（ultraviolet，UV）光譜分析和傅里葉變換紅外（Fourier transform-infrared，F(xiàn)T-IR）光譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證[16]。

1.3.2 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的結(jié)構(gòu)分析

（1）紫外掃描

利用紫外吸收光譜對氯化亞鐵、花生肽及花生肽亞鐵螯合物進(jìn)行紫外掃描和結(jié)構(gòu)解析。

（2）紅外掃描

將花生肽和花生肽亞鐵螯合物提純后，除去樣品結(jié)晶水和游離水，準(zhǔn)確稱取2 mg放入瑪瑙研缽中與干燥光譜純溴化鉀（KBr）200 mg混合研磨均勻（紅外燈下進(jìn)行）、壓片并進(jìn)行紅外光譜掃描和結(jié)構(gòu)解析。

1.3.3 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的熱穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取花生肽亞鐵金屬配位螯合物配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液（pH自然），于10～100℃條件下保溫1h，用無水乙醇沉淀，8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液測定亞鐵螯合率。

1.3.4 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的pH穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取花生肽亞鐵配位螯合物配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液，用0.5 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH至1.0～13.0，于37 ℃保溫1 h，用無水乙醇沉淀，8 000 r/min離心20 min，取上清液測定亞鐵螯合率。

1.3.5 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的醇溶性

準(zhǔn)確稱取1.0 mg花生肽亞鐵，37℃溶解于100 mL不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中（以純水中的花生肽亞鐵溶解度作為參比，定義為100%），8 000 r/min條件離心20 min，取上清液測定亞鐵含量。醇溶性計(jì)算公式如下：

1.3.6 花生肽亞鐵螯合率的測定

采用改進(jìn)的乙醇沉淀法進(jìn)行花生肽亞鐵螯合率的測定[17-18]。取樣品2.00 mL加入8.00 mL無水乙醇，混勻，靜置2 h后于8 000 r/min離心20 min，去除沉淀后將上清液濃縮至2 mL，加入8倍體積的無水乙醇，靜置2 h后8 000 r/min離心20 min，測定上清液中亞鐵含量。鐵含量采取鄰菲啰啉510 nm比色法[16]測定?；ㄉ膩嗚F螯合率計(jì)算公式如下：

式中：M1為2 mL樣品中所含的總鐵含量，mg；M2為上清液中游離鐵含量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生肽亞鐵金屬配位螯合物結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 紫外光譜掃描

為確認(rèn)花生肽與亞鐵是否有效螯合，將氯化亞鐵（FeCl2）、花生肽和花生肽亞鐵螯合物分別進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 FeCl2、花生肽和花生肽亞鐵金屬配位螯合物紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of FeCl2,peanut peptide and peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

由圖1可以看出，氯化亞鐵在波長310 nm處有吸收峰，未螯合花生肽樣品在波長范圍200～400 nm沒有明顯吸收峰，而花生肽亞鐵螯合物在波長215 nm處有明顯吸收峰。其原因是由于多肽與亞鐵螯合后使紫外吸收發(fā)生了位移，由此可推斷，花生肽與亞鐵進(jìn)行了有效螯合[16]。

2.1.2 紅外光譜掃描

分別將花生肽和花生肽亞鐵螯合物進(jìn)行了紅外光譜掃描，結(jié)果如圖2所示。

圖2 花生多肽和花生肽亞鐵金屬配位螯合物紅外吸收光譜圖Fig.2 Infrared absorption spectrogram of peanut peptide and peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

由圖2可以看出，花生肽與亞鐵配位螯合后，紅外圖譜中的一些主要吸收峰發(fā)生明顯變化。在花生肽紅外光譜圖譜中，由于N-H的伸縮振動(dòng)，-NH2在波數(shù)3 404 cm-1處具有吸收峰[19]，而花生肽亞鐵配位螯合后，-NH2峰消失，而在波數(shù)1 110 cm-1處出現(xiàn)了PtNH2吸收峰，由此可以說明，亞鐵離子與多肽中的氨基進(jìn)行配位螯合；此外，在波數(shù)1654.92cm-1和1 226.73 cm-1處有兩個(gè)很強(qiáng)的羰基吸收峰，其波數(shù)差（Δσ）為428.19 cm-1，說明花生肽亞鐵配位螯合后，伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)等受到了遏制[16，20]?；ㄉ膩嗚F配位螯合物中的亞鐵離子可能與羰基以共價(jià)配位健鍵合形成共軛結(jié)構(gòu)環(huán)，花生多肽中氨基N與羧基O均參與了亞鐵的配位螯合[16]，其可能結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 花生肽亞鐵金屬配位螯合物可能結(jié)構(gòu)Fig.3 Possible structure of peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

2.2 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的熱穩(wěn)定性

將10.0 mg/L的花生肽亞鐵金屬配位螯合物于10～100℃條件下保溫1 h，乙醇沉淀后測定花生肽亞鐵螯合率，評價(jià)花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。

圖4 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

由圖4可以看出，溫度在10～60℃范圍內(nèi)，花生肽亞鐵金屬配位螯合物保持較好的熱穩(wěn)定性；溫度超過60℃后，亞鐵螯合率明顯下降。主要是由于溫度過高，花生肽亞鐵熱變性而熱沉，使花生肽亞鐵中的亞鐵離子由結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)[21]。通常情況下，花生肽亞鐵的儲(chǔ)運(yùn)和使用溫度為常溫；溫度37℃條件以下，亞鐵螯合率可保持在88%以上。由此可以說明，花生肽亞鐵金屬配位螯合物具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的pH穩(wěn)定性

考察了花生肽亞鐵配位螯合物在pH值為1～13范圍內(nèi)的pH穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

由圖5可以看出，花生肽亞鐵金屬配位螯合物在pH值為1～8范圍內(nèi)保持較好的穩(wěn)定性。人體胃液的pH值一般在1.5～2.0左右，而花生肽亞鐵在pH值為1～2范圍內(nèi)也能保持80%以上的亞鐵螯合率，由此可以說明，花生肽亞鐵具有較好的酸耐受性，可耐受胃酸的降解作用。當(dāng)花生肽亞鐵作為亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑采用口服給藥時(shí)，可在胃內(nèi)不被胃酸進(jìn)行大量降解，仍可以以結(jié)合形式經(jīng)腸小皮黏膜細(xì)胞進(jìn)入門靜脈有肝臟進(jìn)行代謝[22]。

2.4 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的醇溶性

考察了花生肽亞鐵金屬配位螯合物在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇媒介中的溶解性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 花生肽亞鐵金屬配位螯合物的醇溶性Fig.6 Alcohol solubility of peanut peptide-ferrous metal coordination chelator

由圖6可以看出，花生肽亞鐵金屬配合螯合物在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液媒介中的溶解度存在差異，以水溶液中的溶解度最好（溶解度定義為100%并作對照）。在體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液中也具有較好的溶解性（溶解度為（96.25±1.63）%）；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，花生肽亞鐵溶解度呈下降趨勢，特別是在無水乙醇中溶解度基本不溶[12，14]，高濃度乙醇溶液中溶解性變差，不適宜以高濃度乙醇作為花生肽亞鐵的溶媒。由試驗(yàn)結(jié)果可知，在花生肽亞鐵制劑時(shí)可選擇去離子水或低濃度乙醇濃度作為溶媒。

3 結(jié)論

花生肽亞鐵配位螯合物可作為亞鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑，其穩(wěn)定性是應(yīng)用研究的基礎(chǔ)，研究其穩(wěn)定性可為花生肽亞鐵營養(yǎng)強(qiáng)化劑的制劑研究及儲(chǔ)運(yùn)提供良好理論支持。本研究對花生肽亞鐵進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確診，并分析其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及醇溶性。經(jīng)UV和FT-IR分析確定，花生肽亞鐵成功螯合，亞鐵離子與花生肽配體的羰基以共價(jià)配位健鍵合形成共軛結(jié)構(gòu)環(huán)，多肽中氨基N與羧基O均參與了亞鐵的配位螯合。研究結(jié)果表明，花生肽亞鐵具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性?；ㄉ膩嗚F在10～60℃條件下具有較好的熱穩(wěn)定性，在pH值1～8范圍內(nèi)保持較好的pH值穩(wěn)定性，在純水和體積分?jǐn)?shù)為10%稀乙醇溶液中，花生肽亞鐵保持較好的溶解性，而在高濃度乙醇溶液中溶解性較差。